khảo sát sơ bộ thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng nấm của cao chiết nấm linh chi ganoderma lucidum

--- ∞0∞--- TRẦN KIẾN TƯỜNG KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA CAO CHIẾT NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP

- ∞0∞ -

TRẦN KIẾN TƯỜNG

KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA CAO

CHIẾT NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ∞0∞ -

Giảng viên hướng dẫn: TS LAO ĐỨC THUẬN

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

KHOA CNSH

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Trần Kiến Tường

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Ký tên

Trần Kiến Tường

Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: TS Lao Đức Thuận

Tên đề tài: KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ

HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA CAO CHIẾT NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM)

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên: Trần Kiến Tường được bảo

vệ khóa luận trước Hội đồng:

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu, học tập và thực hiện đề tài “Khảo sát sơ bộ thành

phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng nấm của cao chiết nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)” tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Trường Đại học Mở TP.HCM đã làm

cho em có được nhiều kinh nghiệm trong quá trình làm việc, nắm bắt kiến thức quan trọng, vận dụng những bài giảng đã được học trên ghế nhà trường vào thực tiễn cũng như mở mang tầm nhìn, hiểu biết và tích lũy kinh nghiệm cho bản thân Đây chắc chắn sẽ là hành trang quý giá để em có thể tự tin cho các công việc sau này

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn thầy Lao Đức Thuận đã rất tận tình

hướng dẫn, nâng đỡ, định hướng tư duy và cách làm việc thật khoa học Những góp ý của thầy là những góp ý hết sức quý báo không chỉ trong lúc em thực hiện đề tài mà còn là hành trang vững vàng tiếp sức cho em trong quá trình học tập và công việc sau này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chị Thiều Hồng Huệ và tất cả các bạn, các em ở

phòng thí nghiệm sinh học phân tử và phòng thí nghiệm vi sinh 1, 2 đã nhiệt tình giúp đỡ em giải quyết những khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, con xin cảm ơn đến ba mẹ đã có công sinh thành và nuôi dưỡng con để con có thể tự mình bước qua khó khăn, thử thách trong cuộc sống

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi người!

2 Tổng quan về một số vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm 13

3.2 Thu cao chiết mẫu nấm 26

3.3 Xác định tổng hàm lượng polysachride, polyphenol và định lượng adenosine ……… 28

3.4 Định tính sơ bộ một số nhóm chất có trong cao chiết toàn phần 30

3.5 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 30

3.6 Khảo sát hoạt tính kháng nấm 32

3.7 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa tế bào 34

PHẦN III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1 Kết quả thu cao chiết mẫu nấm 36

2 Kết quả tổng hàm lượng polysachride, polyphenol và định lượng adenosine 38

3.4 Định tính saponin 46

3.5 Định tính phenolic + tanine 47

3.6 Định tính đường khử 48

3.7 Định tính acid uronic 49

4 Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết nấm Linh chi 52

5 Hoạt tính kháng nấm của cao chiết nấm Linh chi 59

6 Hoạt tính chống oxi hóa tế bào của cao chiết nấm Linh chi 63

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1 Kết luận 69

2 Kiến nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hình thái giải phẩu quả thể nấm Linh chi (Trần Minh Hoàng, 2016) 5

Hình 1.2 Chu trình phát triển của nấm Linh chi (Nguyễn Như Quýnh, 2015) 7

Hình 1.3 Công thức phân tử của adenosine 9

Hình 1.4 Công thức phân tử của alkaloid 10

Hình 1.5 Công thức phân tửcủa hợp chất saponin 11

Hình 1.6 Công thức phân tử của Ganoderic acid A và Ganoderic acid B 12

Hình 1.7 Hình ảnh hiển vi của nấm Candida albicans 16

Hình 1.8 Hình ảnh hiển vi của nấm Trichophyton rubrum (https://icarepharma.com.vn/nhiem-nam-kerion-bien-chung-nguy-hiem-cua-benh-nam-da-dau/) 18

Hình 1.9 Hình ảnh hiển vi của nấm Trichophyton mentagrophytes (https://docosan.com/blog/da-lieu/nam-toc/) 18

Hình 1.10 Hình ảnh hiển vi của nấm Microsporum canis (https://phil.cdc.gov/details.aspx?pid=15472) 20

Hình 2.1 Mẫu được bổ sung nước và chiết trong 8h ở nhiệt độ 100°C ……….27

Hình 2.2 Cao chiết sau khi lọc bằng vải mỏng 28

Hình 2.3 Dịch chiết được lọc bằng máy hút chân không 28

Hình 3 9 Định tính phenolic và tanine 47

Hình 3 10 Định tính đường khử trước khi đun 48

Hình 3 11 Định tính đường khử sau khi đun 48

Hình 3 15 Khả năng kháng khuẩn E coli của cao chiết nấm tại nồng độ 200 mg/ml 53

Hình 3 16 Khả năng kháng khuẩn E coli của cao chiết nấm tại nồng độ 400 mg/ml 54

Hình 3 17 Khả năng kháng khuẩn Salmonella typhimurium của cao chiết nấm tại nồng độ 200 mg/ml 54

Hình 3 18 Khả năng kháng khuẩn Salmonella typhimurium của cao chiết nấm tại nồng độ 400 mg/ml 55

Hình 3 19 Khả năng kháng khuẩn Staphylococcus aureus của cao chiết nấm tại nồng độ 200 mg/ml 55

Hình 3 20 Khả năng kháng khuẩn Staphylococcus aureus của cao chiết nấm tại nồng độ 400 mg/ml 56

Hình 3 21 Khả năng kháng nấm Trichophyton mentagrophytes của cao chiết nấm tại nồng độ 400 mg/ml (mặt trên và mặt dưới đĩa) 60

Hình 3 22 Khả năng kháng nấm Microsporum canis của cao tại nồng độ 400 mg/ml 61 Hình 3 23 Khả năng kháng nấm Trichophyton rubrum của cao tại nồng độ 400 mg/ml 61

Hình 3 24 Kết quả định tính hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp TLC 64

Hình 3 25 Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxi hóa của cao chiết từ nấm linh chi 66

Hình 3 26 Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxi hóa của vitamin C 66

Hình 3 27 Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của cao từ bài báo 68

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Khối lượng và hiệu xuất chiết cao của mẫu cao chiết 37

Bảng 3 2 Bảng so sánh hàm lượng polysacharide giữa các mẫu nấm 38

Bảng 3 3 Hàm lượng phenolic của mẫu cao chiết 39

Bảng 3 4Bảng so sánh hàm lượng phenolic giữa mẫu và những bài báo khác 40

Bảng 3 5Các thông số của cao chiết nấm 41

Bảng 3 6Tóm tắt sự hiện diện của các hợp chất tự nhiên có trong cao chiết 49

Bảng 3 7So sánh thành phần hóa học có trong nấm G lucidum và A.subresinosum 51

Bảng 3 8 Khả năng kháng khuẩn của cao chiết 56

Bảng 3 9Bảng so sánh kết quả khả năng kháng khuẩn từ thực nghiệm và bài báo 58

Bảng 3 10Khả năng kháng nấm của cao chiết 62

Bảng 3 11Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa của cao chiết Linh chi 65

Bảng 3 12Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa của vitamin C 65

Bảng 3 13Bảng so sánh khả năng bắt gốc tự do của nấm linh chi thực nghiệm và so sánh từ bài báo 67

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HPLC High-performance liquid chromatography

M canis Microsporum canis

SA Scavenging Activities

T mentagrophytes Trichophyton mentagrophytes

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nấm Linh chi là một họ ăn được quan trọng trong môi trường tự nhiên, nấm

này được phát hiện ở hầu như khắp nơi trên thế giới, chúng phân bố ở hầu hết các khu rừng cận nhiết đới và nhiệt đới và ở Châu Phi, Châu Mỹ và Châu Á, được biết đến và sử

dụng lâu đời nhất ở Ấn Độ, Trung quốc và Việt Nam Linh chi từ lâu đã được xem là một loại dược liệu mang nhiều hợp chất quý Những loài thuộc họ Ganodermataceae

thường được sử dụng hiệu quả trong điều trị thấp khớp, viêm phế quản, hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân đang thực hiện hóa trị liệu cũng như một số bệnh khác (Liu và cộng sự, 2016) Quả thể của nấm Linh chi đã được dùng rộng rãi trong y học cổ truyền Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Việt Nam để điều trị nhiều loại bệnh từ thời cổ đại

(Kleinwachter và cộng sự, 2001) Các sản phẩm từ nấm Linh chi (Ganoderma) được

dùng để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh như bệnh tiết niệu, gan, ung thư, tim mạch, AIDS

Trong quả thể của Ganoderma lucidum có tác dụng kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển

của virus HIV do chứa các hoạt chất khác nhau có hoạt tính kháng virus (Weng và cộng

sự, 2010) Các hoạt chất từ Ganoderma lucidum có tác dụng chống khối u cao, chúng

được sử dụng trong điều trị ung thư: phổi, vú, dạ dày Ngoài ra, các hợp chất từ Linh chi có khả năng hạn chế và loại trừ những tổn thương do phóng xạ ở mô và tế bào và đào thải phóng xạ Các bài báo trước đây cho thấy khả năng sinh ra các hợp chất sinh học có tính chất y học quý của nấm Linh chi là khả quan (Lê Xuân Thám và Trịnh Tam Kiệt, 1995)

Trong nhiều năm trở lại đây, các phương pháp phân tích định tính, định lượng mới đã cho phép xác định hàm lượng lớn các chất hóa học có trong quả thể, tơ nấm và bào tử nấm Linh chi như: saponin, triterpenoids, steroid, polysacharide, amino acid, chất khoáng, … trong đó polysacharide và triterpenoid được xem là thành phần chính mang nhiều hoạt tính sinh học của nấm Tuy các hợp chất sinh học đã được tìm ra nhưng việc phân tích, chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học này chủ yếu thực hiện trên bào tử nấm Ngoài ra việc chiết xuất cao tổng để thực hiện một số hoạt tính sinh học của nấm

Linh chi như: kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa tế bào, chống ung thư,… cũng là một đề tài đáng được quan tâm Vì vậy, với mục đích đóng góp một phần nhỏ của mình vào việc nghiên cứu xác định các hoạt chất có trong quả thể nấm Linh chi và khảo sát một số hoạt tính sinh học của cao chiết từ quả thể nấm, chúng tôi đã có những nghiên

Đề tài này nhằm nghiên cứu về các vấn đề như: Những thành phần hóa học có trong cao chiết của quả thể nấm, khảo sát hoạt tính kháng nấm trên các nồng độ khác nhau Thông qua các kết quả của đề tài, bước đầu có thể giúp chúng ta có thể xác định thành phần loài

liệu quý của nấm Linh chi được nuôi trồng ở Việt Nam

1 Tổng quan về nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)

Chi Ganoderma hiện nay có khoảng 250 loài trên thế giới Trong đó, Ganoderma lucidum là loài được sử dụng nhiều nhất để chăm sóc sức khỏe cho đến thời điểm hiện

tại (Theo Bộ Y tế, 2013)

Nấm Ganoderma lucidum gọi là Lingzhi theo tiếng Trung Quốc, Reishi theo tiếng

Nhật Bản, gọi là nấm Lim, nấm Tiên Thảo hay nấm Trường Thọ ở Việt Nam Ngoài ra còn một số tên gọi khác như của nấm Linh chi như: Bất lão, Chi linh, Nấm lim,… phân bố rộng ở các vùng trên thế giới Tên Linh chi đã được chính thức sử dụng theo sách “Thần nông bản thảo” trong số rất nhiều tên gọi

1.1 Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại thực vật học Donk (1948), nấm Linh chi (Ganoderma lucidum)

có vị trí phân loại như sau:

Chi: Ganoderma (Linh chi)

Loài: Ganoderma lucidum

1.2 Đặc điểm cấu tạo

Nấm Linh chi thường gặp ở dạng quả thể, tai nấm hóa gỗ gồm 2 phần: mũ nấm và cuống nấm (Trịnh Tam Kiệt, 2011)

Thân nấm dài hoặc ngắn, thường đính lệch hoặc đính tâm với mũ nấm Thân nấm có đường kính khoảng 0,3 – 0,8 cm phần lớn có hình trụ mảnh hoặc to chắc có đường kính tới 1,5 – 4 cm, không phân nhánh đôi lúc có uốn lượn có hình vòng cung (do biến dạng trong quá trình nuôi trồng) Lớp vỏ thân màu nâu đỏ, đỏ, nâu đen bóng, không có lông trên mặt nấm

Mũ nấm khi còn non có hình tròn dẹp và sau trở thành hình rẻ quạt Mũ nấm thuôn dài, ít khi có hình vảy, bị biến dạng Trên bề mặt mũ nấm có màu sắc là vàng nghệ, vàng chanh, vàng cam, vàng nâu, nâu tím, đỏ nâu, nâu đen và nhẵn những vân sóng đồng tâm và rãnh phóng xạ, Thường sẫm dần theo tuổi, lớp vỏ bao phủ phía trước mũ, đôi lúc có ánh xanh tía Kích thước tán rất khác nhau, từ 3 – 35 cm đến dày 1 - 4 cm Mặt dưới mũ màu vàng hoặc trắng, phẳng, có nhiều lỗ nhỏ là nơi sinh trưởng và giải phóng bào tử nấm Bào tử nấm bị cắt cụt bởi 2 lớp vỏ có nhiều đoạn nối từ trong ra ngoài Phần đính kèm thân được nâng lên hoặc lõm xuống

Thịt nấm dày 0,5 - 2,3 cm, màu trắng sữa - nâu nhạt – vàng sữa, chia thành lớp dưới và lớp trên Có thể nhìn thấy các sợi nấm hướng lên trên ở các lớp trên Dưới kính hiển vi chỉ thấy những sợi phồng có đầu giống hình que, màng dày đan xen chặt chẽ hình thành lớp vỏ nhẵn (dày khoảng 0,3 - 0,6 mm) Nấm chống được mưa và nắng nhờ lớp bóng không thấm nước Hệ sợi đi xuống đều đặn ở lớp dưới, bên cạnh lớp bào tử

Lớp mầm (lớp tế bào-lớp thụ thể-lớp dưới màng) là một lớp hình ống, dày 0, - 1,9 cm có màu nâu, gồm các ống nhỏ thẳng, miệng gần tròn, màu chanh nhạt, khoảng 2 - 5 ống / mm Holobasidies có dạng bầu dục, dạng que, không màu, dài 15 - 21 µm, với bốn bào tử cơ bản Đôi khi các tác giả mô tả chúng giống như hình bầu dục với các đầu tròn Nó thực sự là do phồng lên của nắp trên hoặc một vết lõm ở thành trong Bào tử có cấu tạo hai mảnh vỏ, màu vàng chanh tươi, có một giọt hình cầu ở giữa các lớp nội chất, giống như giọt nước, bào tử có kích thước rất nhỏ, kích thước thay đổi từ 8 đến 11,5 lần 6- 7,7 µm, phải soi dưới kính hiển vi (Trịnh Tam Kiệt, 2011)

Hình 1.1 Hình thái giải phẩu quả thể nấm Linh chi (Trần Minh Hoàng, 2016)

1.3 Đặc điểm sinh trưởng

Vì nấm Linh chi thuộc nhóm nấm, nên sỡ hữu những đặc tính sau: Sợi nấm có hình ống với vách ngăn Tế bào chất có thể di chuyển dễ dàng từ tế bào này sang tế bào khác do có một vách ngăn không hoàn toàn Sợi nấm phát triển và phân chia thành nhiều nhánh cái và nhánh con (Đỗ Tất Lợi, 1994) Có hai loại sợi nấm Sợi nấm sơ cấp được tạo thành từ các bào tử và các tế bào có một nhân Sợi thứ cấp là sự kết hợp của hai sợi sơ cấp và tế bào có hai nhân Vòng đời của nấm Linh chi, giống như hầu hết các loại nấm khác, bắt đầu bằng một bào tử Bào tử nảy mầm và hình thành ống mầm Đường sinh dục phát triển thành hệ sợi sơ cấp Hai sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành sợi thứ cấp Sợi sơ cấp và sợi phụ kết hợp với nhau tạo thành hệ sợi nấm, hệ sợi nấm này phát triển thành sợi nấm Trong điều kiện thuận lợi (nhiệt độ thấp, độ ẩm tăng), bện của các sợi chỉ tạo thành nút nấm Với nhiệt độ và độ ẩm thích hợp, sợi nấm hình thành chồi

nấm, từ đó phát triển thành chồi, tán và thân nấm trưởng thành, mặt dưới mũ sinh bào tử, phóng thích bào tử và chu kỳ (Đỗ Tất Lợi, 2005)

1.4 Điều kiện và chu trình sống của nấm Linh chi

1.4.1 Điều kiện nuôi trồng

• Nhiệt độ

• pH

tính nằm trong khoảng 4 đến 6

1.4.2 Qúa trình sống

Hình 1.2 Chu trình phát triển của nấm Linh chi (Nguyễn Như Quýnh, 2015)

Chu trình sinh trưởng của nấm Linh chi gồm các giai đoạn như: Qủa thể phóng thích các bào tử ra ngoài môi trường, các bào tử sau khi nảy mầm và phát triển sẽ hình thành các sợi nấm, các sợi nấm này sẽ phân hóa thành các sợi nấm đơn và song nhân, gặp các điều kiện thuẩn lợi các sợi nấm này sẽ hình thành quả thể con và mọc thành quả thể lớn Chu trình này lặp lại nhiều lần (Đỗ Tấn Lợi, 1991)

1.5 Phân bố

Nấm linh chi là loài phân bố rộng khắp trên thế giới, nấm Linh chi mọc ở các tán rừng, sống hoại sinh trên các cây thân gỗ, các cây thuộc họ đậu được đặc biệt chú ý như vành xanh, vành vàng Trong nước, nấm linh chi có ở hầu như tất cả các vùng miền

núi từ Lâm Đồng đến Lào Cai (Đỗ Tất Lợi, 1994) Ganoderma lucidum duy trì chủ yếu

thông qua bào tử Ở nhiều nước, nấm linh chi được dùng cho nhiều lĩnh vực ngoài có ứng dụng trong y học còn được sử dụng để nghiên cứu khoa học Nấm hiện nay đã có thể nuôi trồng trên giá thể do con người tạo ra và cho năng suất tốt

1.6 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

Vai trò

• Tăng cường khả năng miễn dịch cơ thể • Gia tăng sự tổng hợp oxygen

• Giảm sự hình thành gốc tự do hydroxyl • Ức chế sự phát triển của khối u

• Bảo vệ cơ thể khỏi các tia bức xạ • Tăng cường chức năng của gan • Duy trì khả năng tái sinh tủy và cơ

• Tham gia tổng hợp ADN, ARN và protein

1.6.2 Adenosine

Adenosine thuộc nhóm purine có trong cấu trúc nucleic acid đóng vai trò quan trọng Adenosine có nhiều dạng ở trong quả thể nấm Linh chi, hầu hết các dẫn xuất của adenosine đều có hoạt tính dược liệu mạnh

Hình 1.3 Công thức phân tử của adenosine Các chức năng cơ bản của adenosine:

• Duy trì độ nhớt của máu • Giảm sự liên kết của tiểu cầu • Ngăn ngừa cục máu đông

• Hỗ trợ vận chuyển oxy lên não, tăng lượng máu lên não • Tăng cường lưu thông máu trong cơ thể

1.6.3 Alkaloid

Alkaloid là amin chứa nitơ, phần lớn có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, chúng có cấu tạo hóa học và hoạt tính sinh học đa dạng

Hình 1.4 Công thức phân tử của alkaloid

Hầu hết các alkaloid đều không màu và ở trạng thái tinh thể rắn Một số alkaloid xuất hiện ở dạng vô định hình dạng nhựa và một số khác có màu ở dạng lỏng Alkaloid là những hợp chất thể hiện tính bazơ yếu, do có sự hiện diện của một nguyên tử nitơ Tính bazơ của alkaloid thay đổi tùy thuộc vào nguyên tử nitơ gắn vào nhóm thế (R-) Để tạo muối tan trong nước Alkaloid tác dụng với môi trường acid mạnh do có tính bazo yếu Alkaloid dạng tự do thường tan trong dung môi hữu cơ: chloroform, dietyl ete, rượu bậc thấp Các muối alkaloid dễ tan trong nước, rượu và hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ như chloroform, ete, hợp chất vòng benzen, không tan trong nước Tác dụng lên hệ thần kinh

• Điều hòa huyết áp • Kích thích hệ thần kinh

1.6.4 Hợp chất Saponin

Saponin là một loại glycoside bao gồm 2 phần, một phần chứa đường được gọi là glycone, một phần không chúa đường được gọi là aglycone Saponin có những đặc tính cụ thể như tạo ra nhiều bọt hơn làm bề mặt của dung dịch bị giảm sức căng khi hòa tan trong nước Saponin có vị đắng và thường có cấu tạo vô định hình Saponin tác dụng với

axetat chìsẽ tạo kết tủa, bari hydroxit và amoni sulfat cũng tạo kết tủa khi tác dụng với saponin (Lê Xuân Thám, 1996)

Hình 1.6 Công thức phân tử của Ganoderic acid A và Ganoderic acid B

Triterpenoids là những hợp chất được tổng hợp từ sáu đơn vị isopren Các

trong thực vật Các triterpenoid không chứa đường tồn tại ở dạng tự do, có cấu trúc dạng vòng và kết hợp với một số nhóm chức như: -Oac; -OH; Carbanil C=O; eter -O-; nối đôi C=C Đặc điểm chung là có tính ưa béo (tan tốt trong eter dầu hỏa, hexane, eter ethyl, chloroform), thực tế là không tan trong nước trừ trường hợp tạo thành phức với đường tạo thành glycosid (Nguyễn Phước Nhuận, 2001; Trần Hùng, 2004)

Ganoderic acid Y, B, S, D, K, F, H Ganodermic acid Mf

Ngăn chặn tổng hợp cholesterol Ganodermic acid T.O

Ganodermic acid

histamin

Ngoài ra các hợp chất từ ganoderic acid còn có chức năng khác như: bảo vệ

ganvà ngăn ngừa khối u

2 Tổng quan về một số vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm

2.1 Escherichia coli

Phân loại Giới: Bacteria

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales

Họ: Enterobacteriaceae

Chi: Escherichia

Loài: Escherichia coli (Buchanan và Gibbons, 1994)

E coli là loài thuộc chi Escherichia, là trực khuẩn Gram âm di động thuộc loại

trưởng từ 10 - 46oC Mọc dễ dàng trong môi trường Mac Conkey, EMB…

E coli là một loại vi khuẩn hay được tìm thấy trong ruột của người và động vật máu nóng Vi khuẩn E coli có thể gây ra các bệnh như: nhiễm trùng đường tiết niệu,

nhiễm trùng máu, viêm màng não cấp và bệnh tiêu chảy (James P Nataro và cộng sự, 1998)

Tình hình gây bệnh của các chủng E coli đang ngày càng nghiêm trọng Theo

Tổ chức y tế thế giới (WHO) đã thống kê có khoảng 525.000 trẻ em mỗi năm tử vong

do bệnh tiêu chảy gây ra bởi E coli và bệnh tiêu chảy là nguyên nhân thứ hai gây tử

vong ở trẻ em dưới 5 tuổi

Theo Mark Melzer và cộng sự (2007) cho biết ngoài gây tử vong

cao, vi khuẩn E.coli càng ngày khó điều trị bằng kháng sinh do đã xuất hiện nhiều chủng E coli kháng thuốc như các chủng E coli sinh ESBL đều đề kháng với

cephalosporin Kháng ciprofloxacin, trimethoprim, gentamicin và amikacin lần lượt là 91,3; 84,8%; 30,4% và 4,3% Tỷ lệ bệnh nhân tử vong cao đáng kể do vi khuẩn gây ra

bởi E coli sản sinh ESBL là 60,8%, so với E coli không sản xuất ESBL

Theo Betina Hebbelstrup Jensen và cộng sự (2014) cho biết vào năm 2011 tại

Đức bệnh viêm đại tràng xuất huyết do một chủng E coli gây ra đã khiến 54 người

chết Theo Tổ chức y tế thế giới (WHO) cho biết tình trạng kháng thuốc kháng sinh

fluoroquinolone ở E coli, được sử dụng để điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu đang phổ biến, tỷ lệ E coli kháng cephalosporin thế hệ thứ ba là 36,0%

2.2 Pseudomonas aeruginosa

Phân loại

Ngành : Proteobacteria

Lớp : Gamma Proteobacteria Bộ : Pseudomonadales

Họ: Pseudomonadaceae

Chi : Pseudomonas

Loài: Pseudomonas aeruginosa (Buchanan và Gibbons, 1994)

P aeruginosa là trực khuẩn mủ xanh, thẳng hoặc hơi cong có đơn mao ở một đầu,

nhờ đó di động kích thước 0,6 × 2 μm, hiếu khí tuyệt đối, mọc dễ trên hầu hết các môi trường thông dụng, có thể phát ra mùi thơm giống mùi nho (grapelike odor) Mọc tốt ở

thể tiết ra 4 loại sắc tố: pyoverdin, pyocyanin, pyomelanin (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)

Khả năng gây bệnh

Trực khuẩn mủ xanh tiết ra nhiều enzyme và độc tố khác nhau Vi khuẩn này gây bệnh khi: xạ trị, hóa trị, sức đề kháng của cơ thể bệnh nhân suy giảm, niêm mạc da và mô của bệnh nhân bị tổn thương, sử dụng các dụng cụ y khoa, lạm dụng kháng sinh, tiêu diệt hết vi khuẩn thường trú ở ruột… chúng gây nhiễm trùng da, mắt như viêm nang lông, viêm da chảy nước ở các vùng kẽ hoặc viêm tai ngoài, viêm loét giác

mạc,… ngoài ra P aeruginosa là căn nguyên gây nhiễm trùng vết bỏng, vết thương,

xương khớp, huyết, dịch não tủy, tiết niệu và hô hấp (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)

2.3 Salmonella typhimurium

Phân loại:

Phân ngành: Proteobacteria

Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales

Họ: Enterobacteriaceae

Chi: Salmonella

Loài: Salmonella typhimurium (Buchanan và Gibbons, 1994)

S typhimurium là trực khuẩn có lông xung quang thân, Gram âm, có khả năng di động và không sinh nha bào Kích thước khoảng 0,3-0,8 × 2–3 μm S typhimurium

là vi khuẩn hiếu khí tùy vào điều kiện môi trường, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường Trong môi trường thích hợp sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước trung bình 2 - 4 mm

Khả năng gây bệnh

S typhimurium gây bệnh cho người, đặt biệt là gây bệnh thương hàn Bệnh

thương hàn có thể gây biến chứng chủ yếu là xuất huyết tiêu hóa và thủng ruột Một

số biến chứng ít gặp hơn như viêm màng não, viêm tủy xương, viêm khớp, viêm thận (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)

Họ: Saccharomycetaceae

Chi: Candida (Theo Maheshwari, 2010)

Hình 1.7 Hình ảnh hiển vi của nấm Candida albicans

s159-n18001)

(https://medlatec.vn/tin-tuc/nam-candida nguyen-nhan-chu-yeu-gay-viem-am-dao-Nấm men Candida có hình tròn hay hình bầu dục, sinh sản bằng các nảy chồi hay

cho sợi tơ nấm giả và bào tử bao dầy

C albicans là thành viên của hệ vi nấm ở da và niêm mạc người Nó là nhân tố

gây nhiễm khi có sự biến đổi của môi trường và cơ thể cho phép nó sinh trưởng ngoài

tầm kiểm soát C albicanns thường sống không gây hại ở màng nhầy của người và động

vật máu nóng (miệng, âm đạo, ruột,…) và không thấy ở trên da với dạng đơn bào Ở một số điều kiện thuận lợi, nấm này phân thành các dạng sợi để xâm nhập vào màng nhầy, sinh trưởng không kiểm soát gây ra bệnh khá nghiệm trọng

C albicans là tác nhân gây ra một số bệnh ở người ở các vị trí như da, móng,

niêm mạc Vi nấm này có thể xâm nhập vào sâu các cơ quan khác gây nhiễm máu và bệnh nấm nội tạng rất nguy hiểm Khả năng tồn tại ở hai dạng hình thái là tế bào và dạng sợi giúp loài này có khả năng nhanh chóng chuyển đổi hình thái trong điều kiện thích hợp và khó bị tiêu diệt (Trần Linh Thước, 2006; Maheshwari, 2010)

3.2 Trichophyton spp

Giới: Nấm

Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes

Bộ: Onygenales

Họ: Arthrodermataceae Chi: Trichophyton

Hình 1.8 Hình ảnh hiển vi của nấm Trichophyton rubrum

da-dau/)

(https://icarepharma.com.vn/nhiem-nam-kerion-bien-chung-nguy-hiem-cua-benh-nam-Hình 1.9 (https://icarepharma.com.vn/nhiem-nam-kerion-bien-chung-nguy-hiem-cua-benh-nam-Hình ảnh hiển vi của nấm Trichophyton mentagrophytes (https://docosan.com/blog/da-lieu/nam-toc/)

Trichophyton spp Có bào tử đính lớn, khi trưởng thành có dạng phẳng và thường

có từ 1 đến 12 vách ngăn mỏng Chúng được tạo ra thành các chùm nhỏ hoặc các hạt đơn lẻ, hình trụ hình thùy, hình thoi, Kích thước duy trì trong khoảng chiều dài 6 – 88

μm, chiều ngang 3 – 13 μm Bào tử đính lớn thường ít hơn các bào tử đính nhỏ, chúng có thể là dạng hình quả lê, hình cầu, hoặc hình chùm, không cuống và được tạo ra đơn lẻ dọc theo 2 bên sợi nấm hoặc thành cụm giống như chùm nho.

T rubrum có thể gây ra bệnh về da như nấm móng, biểu hiện dưới dạng tróc vẩy

khô, mụn nước hoặc viêm Bệnh gây ngứa ngáy, khó chịu Các bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS dễ mắc các bệnh nhiễm trùng cơ hội Khi hệ miễn dịch của cơ thể suy yếu

bệnh do nấm T rubrum gây ra chiếm 35,7 %

Hầu hết các trường hợp nhiễm trùng là do T rubrum gây nên Khi bị nấm xuất

hiện nhiều ở bàn tay, lòng bàn tay và phía trong ngón tay là nơi thưởng bị ảnh hưởng nhất, dấu hiệu thường thấy nhất là sừng lan tỏa diện rộng ở lòng bàn tay sau đó ra mu tay, rồi đến các ngón tay

Biểu hiện tổn thương do nấm Trichophyton mentagrophytes thường khác nhau

vết thương đường kính từ 1 - 2 cm đến hàng chục cm, da đầu bị bong vảy, tóc bị rụn cụt sát mặt da, chân tóc còn lại bị vẩy trắng vụn bao quanh giống như tóc bị nhúng trong bột mì (Weitzman, 1995)

3.3 Microsporum canis

Giới: Nấm

Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes

Bộ: Onygenales

Họ: Arthrodermataceae

Chi: Microsporum

Hình 1.10 Hình ảnh hiển vi của nấm Microsporum canis (https://phil.cdc.gov/details.aspx?pid=15472)

Microsporum canis là một loại nấm da phổ biến ở chó và mèo, loại nấm này

thường sống kí sinh trên lông ở vùng đầu, chân, đuôi và một vài nơi khác của cơ thể Trong một số trường hợp nghiêm trọng thì vùng da bị ảnh hưởng sẽ trở nên đỏ và chảy mủ Sợi nấm trưởng thành nhanh chóng, các khuẩn lạc có màu trắng tới vàng sẫm, màu vàng tươi hoặc màu vàng cam ở mặt sau.

Microsporum canis có đặc điểm là bào tử đính lớn có những vách ngăn thô ráp

do có nhiều điểm nhỏ, gai nhỏ, hoặc nhiều mụn cơm Ban đầu, bào tử đính lớn được mô tả bởi Chester Emmons (1934), chúng có hình dạng như hình con quay hoặc hình thoi Bào tử đính lớn có thể có vách mỏng, hơi dày cho đến dày, có từ 1 đến15 vách ngăn và kích thước nằm trong khoảng chiều dài 6 − 160 μm, chiều rộng 6 − 25 μm Bào tử đính

nhỏ không có cuống hoặc có cuống và có dạng hình chùm, thường được bố trí đơn lẻ dọc theo sợi nấm hoặc có dạng chùm (Weitzman I và Summerbell R.C., 1995)

+ Microsporum canis là nguyên nhân thường gặp gây nấm ngoài da ở người, đặc biệt là

trẻ em Xâm nhập vào da, tóc, móng tay

+ Mèo và chó là nguồn lâu nhiễm chính, nó cũng có thể được truyền sang người thông qua tiếp xúc trực tiếp và gián tiếp với động vật và vật truyền bệnh như lược, bàn chãi, mũ, đồ nội thất

+ Các yếu tố nguy cơ lớn nhất đối với nhiễm trùng là liên hệ với các tế bào bị hư hại trên

da, tóc và móng tay Microsporum canis có thể lây nhiễm tất cả các loài động vật có vú

4 Khái quát phương pháp thử hoạt tính kháng nấm 4.1 Phương pháp khuyết tán

Nguyên tắc: Chất thử từ đĩa giấy hay giếng đục trong thạch sẽ khuyết tán vado môi trường thạch được nuôi cấy vi nấm thử nghiệm Mức tác động của chất thử được đánh giá dựa vào đường kính vòng ức chế Phương pháp này cho kết quả định tính và bán định lượng hoạt tính của chất thử

Tùy vào từng loại vi nấm thử nghiệm ta có thể chọn môi trường phù hợp Đối với các vi nấm khó mọc thì các tiêu chuẩn về môi trường phải được biến đổi cho phù hợp, bổ sung các hợp chất cần thiết đối với mỗi loại vi nấm

4.2 Phương pháp pha loãng liên tiếp

Nguyên tắc: Dựa trên sự tương quan giữa nồng độ pha loàng của chất thử đối với sự tăng trưởng của vi nấm trong mỗi nồng độ chất thử khác nhau mà ta xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của chất thử có khả năng ngăn chặn sử tăng trưởng của vi nấm thử nghiệm

Chất thử được pha loãng thành các nồng độ từ cao đến thấp theo cấp số nhân Tác động kháng các loại vi nấm sẽ được xác định dựa vào nồng độ ức chế tối thiểu của chất thử (Minimum Inhibitory Concetration – MIC) Đây là nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ ức chế được sự phát triển của vi nấm Phương pháp này có ý nghĩa là định lượng MIC càng thấp thì chất thử tác động càng mạnh

Các tiêu chuẩn về phương pháp pha loãng hiện đang được sử dụng:

+ Phương pháp pha loãng xác định hoạt tính kháng nấm men: CLSI, 2018, M27 – A3 + Phương pháp pha loãng xác định hoạt tính kháng nấm sợi: CLSI, 2018, M38 – A2 + Phương pháp pha loãng xác định hoạt tính kháng khuẩn: CLSI, 2009, M7 – A8

5 Tình hình nghiên cứu

Ở Việt Nam các tác giả nghiên cứu về họ nấm Ganodermataceae Donk, phần lớn tập trung nghiên cứu ở các miền Bắc như tác giả Trịnh Tam Kiệt (1980, 1981, 1996, 2011, 2012…), Phan Huy Dục và cộng sự (2004), Đảm Nhận (1996), Mai Văn Phô và Nguyễn Nghĩa Thìn (2003), các công trình này nghiên cứu về tính đa dạng của họ nấm

Ganodermataceae ở khu vực phía Bắc Ở Miền Trung có tác giả Ngô Anh (2003, 2007), đã nghiên cứu về thành phần loài của họ nấm Ganodermataceae ở tình Thừa Thiên Huế

Khu vực miền núi phía Tây Nguyên có tác giả Lê Bá Dũng đã mô tả chi tiết 13 loài gồm

2 chi Ganoderma và Amauroderma ở Nam Tây Nguyên Ở miền Nam có tác giả Lê Xuân

Thám (1996, 2005, 2009, 2011) đã nghiên cứu thành phần loài của họ nấm

Ganodermataceae ở Vườn Quốc gia Cát Tiên Nguyễn Phương Đại Nguyên (2013) đã nghiên cứu về chi nấm Ganoderma trong các công trình nghiên cứu về nấm lớn của ông

Trên thế giới việc nghiên cứu về nấm Linh chi đã được thực hiện bởi nhiều tác giả: Iarevskii (1913), Khincova S và cộng sự (1986) các tác giả này chỉ tập trung nghiên

cứu những đặc trưng cơ bản của họ nấm Ganodermataceae Patouillard (1928) và

Steyaert (1972) đã nghiên cứu rất rộng về giới Nấm trong đó có nấm Linh chi Tuy nhiên,

các tác giả chỉ xây dựng khóa phân loại cho các bộ trong giới Nấm mà chưa đề cập đến việc các hợp chất và hoạt tính sinh học có trong nấm Ryvarden L, Johansen, I (1991,

2000) đã nghiên cứu khá chi tiết về những đặc trưng của họ nấm Ganodermataceae

Năm 2016, xác định thành phần hóa học của hệ sợi nấm của 5 loài nấm Linh chi có nguồn gốc từ Việt Nam và 3 loài nấm Linh chi từ Châu Âu và vùng Siberia do Tsivileva và cộng sự thực hiện

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Vật liệu

1.1 Bộ mẫu nấm

Mẫu nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được thu nhận từ Lâm Đồng

1.2 Thiết bị, dụng cụ, môi trường và hóa chất

1.2.1 Thiết bị

⮚ Tủ cấy vô trùng ⮚ Nồi hấp

⮚ Tủ sấy ⮚ Tủ lạnh ⮚ Tủ ấm ⮚ Microwave ⮚ Bếp điện

⮚ Cân kĩ thuật và cân phân tích

1.2.2 Dụng cụ

⮚ Ống nghiệm ⮚ Đĩa petri ⮚ Becher ⮚ Erlen ⮚ Ống đong ⮚ Phễu

⮚ Đũa thủy tinh ⮚ Que cấy ⮚ Đèn cồn

1.2.3 Hóa chất

⮚ Potato Dextrose Agar (PDA) ⮚ Sabouraud Dextrose Agar (SDA) ⮚ Nutrient Agar (NA)

⮚ Mueller Hinton Agar (MHA) ⮚ Thuốc thử Mayer

⮚ Thuốc thử fehling A ⮚ Thuốc thử fehling B ⮚ Thuốc thử Trim Hill ⮚ Bột magie

⮚ Acid sulfuric 10%

⮚ HCl đđ ⮚ NaOH ⮚ Mg ⮚ H2SO4 đđ