Đang tải... (xem toàn văn)
BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: KHẢO SÁT MỨC ĐỘ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN PSEUDOMONAS AERUGINNOSA PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI BỆNH VIỆN NHI ĐỒNG 1 TỪ THÁNG 3/2018 ĐẾN 2/2019 KHOA C
Trang 1BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Tên đề tài:
KHẢO SÁT MỨC ĐỘ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH
CỦA VI KHUẨN PSEUDOMONAS AERUGINNOSA
PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI BỆNH VIỆN NHI ĐỒNG 1 TỪ THÁNG 3/2018 ĐẾN 2/2019
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: Y DƯỢC
GVHD: ThS BS Lê Quốc Thịnh GVĐHD: ThS Dương Nhật Linh
SVTT: Dương Thị Hồng Dư MSSV: 1553010029
Khóa: 2015 – 2019
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
KHẢO SÁT MỨC ĐỘ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH
CỦA VI KHUẨN PSEUDOMONAS AERUGINOSA
PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI BỆNH VIỆN NHI ĐỒNG 1 TỪ THÁNG 3/2018 ĐẾN 2/2019
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: CNSH Y DƯỢC
XÁC NHẬN CỦA GVHD XÁC NHẬN CỦA GVHD
- -
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Bs Lê Quốc Thịnh và cô ThS Dương Nhật Linh Thầy và cô đã định hướng và tận tình hướng dẫn cho em những kiến thức chuyên môn để em hoàn thành tốt báo cáo khóa luận tốt nghiệp này
Em xin gửi lời cảm ơn đến các cô, chú, anh, chị trong khoa Vi sinh - Bệnh viện Nhi Đồng 1 đã trực tiếp truyền đạt các kiến thức, hướng dẫn các kĩ thuật chuyên môn và luôn giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp
Em xin chân thành biết ơn đến sự tận tình dạy dỗ, truyền đạt và chia sẻ những kiến thức bổ ích của tất cả các quý thầy cô, cùng các anh, chị khóa trên và các bạn trong khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Mở Tp.HCM
Lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất, em xin gửi đến gia đình, cha, mẹ đã sinh thành và nuôi dạy em, luôn sát cánh động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em học tập và hoàn thành tốt báo cáo thực tập của mình
Trang 4DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
1AB Khoa ngoại tổng hợp 1I Khoa nhiễm
2AB Khoa phỏng, chỉnh hình 2CD Khoa nội tổng quát 2 2I Khoa Thận
3B Khoa tim mạch 3CD Khoa hô hấp
3I Khoa sốt xuất huyết AN Dịch ổ bụng
Trang 5GEN Gentamicin
HSN Khoa hồi sức ngoại
I Intermediate –Trung gian IMP Imipenem (10 µg)
SS Khoa sơ sinh
TBBM Tế bào biểu mô
TBBC Tế bào bạch cầu
TCC Ticarcillin/clavulanic acid (75/10 µg)
TH Khoa tiêu hóa
TMH Khoa tai mũi họng
Trang 6DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 : Qui định đặt đĩa kháng sinh đồ……… 18
Bảng 2.2 : Thang điểm Barlett dùng đánh giá mẫu đàm………21
Bảng 2.3 : Môi trường nuôi cấy phân lập……… 22
Bảng 2.4 : Phản ứng sinh hóa vi khuẩn Gram âm dễ mọc……… 27
Bảng 2.5 : Thử nghiệm sinh hóa trong định danh P aeruginosa……… 29
Bảng 2.6 : Tiêu chuẩn đường kính vòng vô khuẩn của Pseudomonas aeruginosa… 32
Bảng 3.1 : Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa theo giới tính……….34
Bảng 3.2 : Phân bố theo độ tuổi 35
Bảng 3.3 : Tỷ lệ phân bố vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa theo bệnh phẩm 36
Bảng 3.4 : Tỷ lệ phân bố vi khuẩn P aeruginosa phân lập được theo khoa điều trị 38
Bảng 3.5 : Kết quả kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby-Bauer……… 40
Trang 8DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ - BIỂU ĐỒ
Sơ đồ 2.1 : Phương pháp nghiên cứu P aeruginosa……… 28 Biểu đồ 3.1 : Tỷ lệ phân bố vi khuẩn P aeruginosa theo giới tính….……… 34 Biểu đồ 3.2 : Tỷ lệ phân bố vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa theo tuổi………35 Biểu đồ 3.3 : Tỷ lệ phân bố vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa theo bệnh phẩm……37 Biểu đồ 3.4 : Tỷ lệ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập được theo khoa lâm sàng điều trị (N = 247)……… 39
Biểu đồ 3.5 : Tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa……….41
Biểu đồ 3.6 : Tỷ lệ nhạy, trung gian, kháng kháng sinh của P aeruginosa………… 42
Trang 9MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN PSEUDOMONAS AERUGINOSA 4
I.1.1 Đặc tính và phân loại 4
I.1.2 Khả năng gây bệnh 6
I.1.3 Phòng ngừa và điều trị 7
I.2 NHIỄM TRÙNG BỆNH VIỆN 8
I.2.1 Khái niệm 8
I.2.2 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa gây nhiễm trùng bệnh viện 8
I.3 KHÁNG SINH 8
I.3.1 Định nghĩa 8
I.3.2 Phân loại 8
I.3.3 Kháng sinh Carbapenem và enzyme carbapenemase 9
I.3.4 Cơ chế tác động của kháng sinh 10
I.3.5 Cơ chế đề kháng kháng sinh 12
I.4 SƠ LƯỢC TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỰ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC 12
I.4.1 Trong nước 12
I.4.2 Trên thế giới 15
PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 17
Trang 10II.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 17
II.2.1 Vật liệu nghiên cứu 17
II.2.2 Môi trường 17
II.2.3 Đĩa kháng sinh 17
II.2.4 Sinh phẩm, hóa chất và thuốc thử 19
II.2.5 Thiết bị và dụng cụ 19
II.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
II.3.1 Khai thác dữ liệu khoa học 20
II.3.2 Phương pháp thực hiện 20
II.3.3 Định danh Pseudomonas aeruginosa 26
II.3.4 Thử nghiệm bằng máy định danh Vitek-2 29
II.3.5 Thử nghiệm kháng sinh đồ theo phương pháp Kirby-Bauer 30
II.3.6 Thử nghiệm khả năng sản xuất enzyme carbapenemase 33
PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN III.1 ĐẶC TÍNH BỆNH NHÂN 34
III.1.1 Phân bố vi khuẩn theo giới tính 34
III.1.2 Phân bố vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa theo độ tuổi 35
III.2 SỰ PHÂN BỐ CỦA VI KHUẨN PSEDOMONAS AERUGINOSA THEO BỆNH PHẨM 36
III.3 SỰ PHÂN BỐ CỦA VI KHUẨN PSEDOMONAS AERUGINOSA THEO KHOA LÂM SÀNG 38
III.4 KHẢO SÁT MỨC ĐỘ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN PSEUDOMONAS AERUGINOSA 40
III.4.1 Tỷ lệ nhạy, trung gian, kháng kháng sinh của P aeruginosa 42
III.5 TỶ LỆ VI KHUẨN TIẾT MEN CARBAPENEMASES 42
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ IV.1 KẾT LUẬN 44
Trang 11VI.1.2 Sự phân bố của vi khuẩn 44
VI.1.3 Mức độ kháng kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa 44
VI.2 ĐỀ NGHỊ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO 46
Trang 12ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa là một trong những tác nhân hàng đầu gây
nhiễm khuẩn bệnh viện Pseudomonas aeruginosa gây ra những bệnh lí với nhiều mức
độ nặng nhẹ khác nhau như viêm phổi, nhiễm khuẩn vết thương, nhiễm khuẩn huyết với tỷ lệ tử vong khá cao Ở Mỹ, theo báo cáo của hệ thống giám sát nhiễm khuẩn bệnh
viện quốc gia, vi khuẩn P.aeruginosa đứng thứ hai trong số tất cả các tác nhân gây
nhiễm trùng bệnh viện liên quan đến bệnh viêm phổi (Centers for Disease Control and PreventionAntibiotic (CDC), 2011)
Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn P aeruginosa đã tăng dần trong những
năm gần đây trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng Cùng với sự gia tăng về tỷ lệ nhiễm khuẩn là sự gia tăng về khả năng đề kháng kháng sinh, cụ thể là đề kháng với kháng sinh nhóm carbapenem Theo báo cáo năm 2013 của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (Centers for Disease Control and Prevention), ước tính ở Hoa Kỳ có hơn 2.000.000 người mắc bệnh mỗi năm với bệnh nhiễm trùng kháng thuốc kháng sinh thì trong đó có ít nhất 23.000 người chết và có khoảng 51.000 ca
nhiễm bệnh liên quan đến vi khuẩn P aeruginosa Trong các ca nhiễm trùng có liên quan đến vi khuẩn P aeruginosa thì có hơn 6.000 (13%) là vi khuẩn đa kháng thuốc,
với khoảng 400 ca tử vong do nhiễm trùng (Centers for Disease Control and PreventionAntibiotic (CDC, 2013) Tại Anh, theo một kết quả nghiên cứu của tác giả
T L Pitt (2003), có 50% số chủng vi khuẩn P aeruginosa đề kháng với Gentamicin,
39% đề kháng với Ceftazidime, 32% đề kháng với Piperacillin và 30% đề kháng với Ciprofloxacin (Somayeh Moazami-Goudarzi, Fereshteh Eftekhar, 2013)
Còn tại Việt Nam, nghiên cứu ở 36 bệnh viện các tỉnh phía Bắc trong thời gian 2006 – 2007 ở 2 bệnh viện tuyến trung ương, 17 bệnh viện tuyến tỉnh, 17 bệnh viện tuyến huyện cho thấy có 553 ca trên tổng số 7.571 (tỷ lệ 7,8%) bệnh nhân mắc nhiễm trùng bệnh viện (HAIs) Có 3 loại nhiễm trùng bệnh viện thường gặp là viêm phổi (41,9%), nhiễm khuẩn vết mổ (27,5%), nhiễm khuẩn đường tiêu hóa (13,1%) Tác
Trang 13nhân vi khuẩn chính là vi khuẩn Acinetobacter baumannii (23,3%) và vi khuẩn
Pseudomonas aeruginosa (31,5%) (Nguyễn Văn Hùng và cs., 2008) Theo kết quả
nghiên cứu từ 4 bệnh viện tại Hà Nội là bệnh viện Việt Đức, bệnh viện Xanh Pôn, bệnh
viện 108 và bệnh viện 103 trong thời gian 2005 – 2008 đã cho thấy vi khuẩn P
aeruginosa phân lập từ các bệnh phẩm đề kháng rất cao với các loại kháng sinh như
Tetracycline (92,1%), Ceftriaxone (58,5%) và Gentamicin (54%) (Bùi Khắc Hậu và nhóm tác giả, 2008) Theo báo cáo của tác giả Trần Thanh Nga tại Hội nghị đề kháng
kháng sinh trong viêm phổi cộng đồng và viêm phổi bệnh viện năm 2013, vi khuẩn P
aeruginosa là một trong những tác nhân (đứng thứ 4) trong các tác nhân gây nhiễm
khuẩn hô hấp với tỷ lệ 11,1% và mức độ đề kháng kháng sinh cũng tăng dần qua các năm (Trần Thanh Nga, 2013)
Tình hình đề kháng đa kháng sinh của vi khuẩn P aeruginosa được ghi nhận
trong một số nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam cho cho thấy sự gia tăng về tình
hình nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn P aeruginosa cũng như khả năng kháng lại
kháng sinh của vi khuẩn này gây nên, làm tăng tỷ lệ bệnh tật, tăng tỷ lệ tử vong và tăng
chi phí điều trị Đây là lí do để thực hiện đề tài “Khảo sát mức độ đề kháng kháng
sinh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa phân lập được tại bệnh viện Nhi Đồng
1 từ tháng 3/2018 đến tháng 2/2019” nhằm góp phần xây dựng phác đồ điều trị kháng
sinh hợp lý các trường hợp nhiễm trùng nói chung và nhiễm trùng do vi khuẩn P
aeruginosa nói riêng
Trang 14MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Mục tiêu tổng quát:
“Khảo sát mức độ đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
phân lập được tại bệnh viện Nhi Đồng 1 từ tháng 03/2018 đến tháng 2/2019”
carbapenemase
Trang 15PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Trang 16I.1 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN PSEUDOMONAS
I.1.1 Đặc tính và phân loại
Hình thái
P aeruginosa có hình dạng thẳng
hoặc hơi cong nhưng không xoắn, 2 đầu tròn, kích thước 0,5-1 µm x 1,5-5 µm, là trực khuẩn hiếu khí Gram âm Có một lông duy nhất ở 1 cực, các pili của chúng dài khoảng 6 nm, nơi tiếp nhận nhiều loại phage và giúp vi khuẩn gắn vào bề mặt của tế bào vật chủ.Vi khuẩn
P aeruginosa là loài vi khuẩn không
sinh bào tử (Lê Huy Chính, 2003)
Hình 1.1 : Hình thái P aeruginosa dưới kính hiển vi
Đặc điểm nuôi cấy
Trực khuẩn mủ xanh mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, điều kiện hiếu khí tuyệt đối Nuôi cấy trên môi trường thạch máu hay thạch dinh dưỡng Trên môi trường đặt thường có 2 loại khuẩn lạc: một loại to, dẹt, nhẵn, trung tâm hơi lồi như quả trứng rán; một loại nhỏ, xù xì, lồi, cũng có khi gặp loại thứ ba, khuẩn lạc nhầy, có màu xanh ánh kim (Lê Huy Chính, 2003)
Tính chất sinh hóa
Trang 17P aeruginosa không lên men đường glucose, thử nghiệm oxidase dương tính,
catalase dương tính và gây tiêu huyết β trên thạch máu
P aeruginosa thường sinh sắc tố trên môi trường nuối cấy:
- Pyocyanin: có màu xanh lơ, tan trong nước và chloroform, khuếch tán ra môi
trường agar và không phát huỳnh quang P aeruginosa là vi khuẩn duy nhất tiết ra
pyocyanin
- Pyoverdin: sắc tố huỳnh quang, phát màu xanh khi chiếu tia cực tím có bước sóng 400 nm, không bền vững và mất đi nếu môi trường không chuẩn.Một số loài vi khuẩn có khả năng tiết ra sắc tố pyorubin (có màu đỏ sẫm) hoặc pyomelanin (có màu đen) (Jawetz và cs, 1989; Đoàn Thị Nguyện, 2012)
Pyocyanin Pyoverdin
Hình 1.2 : Hai loại sắc tố chính của P aeruginosa
(Ảnh chụp tại bệnh viện)
Khả năng đề kháng
Vi khuẩn P aeruginosa bị tiêu diệt ở nhiệt độ 100°C; chúng sống trong đất,
nước; trong môi trường ẩm, thoáng và không có ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, chúng sống được hàng tuần; trong môi trường có dinh dưỡng tối thiểu đặt ở 5°C, chúng sống được hơn 6 tháng (Lê Huy Chính, 2003)
Cấu tạo kháng nguyên
Trang 18Kháng nguyên O chịu nhiệt, bản chất hóa học là lipopolysaccharid (LPS), dựa
vào kháng nguyên này người ta chia P aeruginosa thành 12 nhóm Kháng nguyên H
không chịu nhiệt, là kháng nguyên lông Vì khó khăn trong việc điều chế, nên việc định type huyết thanh dựa trên kháng nguyên này chưa được áp dụng rộng rãi (Lê Huy Chính, 2003)
Phân bố
Do trực khuẩn mủ xanh có khả năng sống tốt trong môi trường thiếu dinh dưỡng nên chúng thường được tìm thấy hầu hết trong môi trường bệnh viện, trên các dụng cụ
mổ, tay nhân viên y tế diệt khuẩn chưa hiệu quả Trên cơ thể người, vi khuẩn P
aeruginosa được tìm thấy trên da, đàm, mủ, nước tiểu, dịch tiết âm đạo, các vết
thương, vết bỏng, dịch não tủy, và trong máu bệnh nhân nhiễm trùng huyết do P
aeruginosa (Lê Huy Chính, 2003) Phân loại
Giới: Bacteria (Vi khuẩn)
Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamaproteobacteria
Loài: Pseudomonas aeruginosa
Theo Bergey’s (1974), giống Pseudomonas được phân chia thành 96 loài khác nhau, trong đó vi khuẩn P aeruginosa là một trong 12 loài có nhiều liên quan đến y
học (Lê Huy Chính, 2003)
I.1.2 Khả năng gây bệnh
Chính nhờ các fimbrae (pili) đã giúp P aeruginosa có thể bám dính một cách dễ dàng lên tế bào vật chủ Ngoài ra, có nhiều chủng P aeruginosa có khả năng tiết ra các
enzym như: elastase, protease đóng vai trò trong quá trình xâm nhiễm (Jawetz và cs,
Trang 191989) Vi khuẩn này tiết ra nhiều enzym và độc tố khác nhau như: hemolysin, lipase, esterase, elastinase, deoxyribonuclease, phospholipase, độc tố ruột và nội độc tố (Nguyễn Thanh Bảo, 2011)
P aeruginosa gây bệnh khi gặp các điều kiện sau:
- Sức đề kháng của cơ thể bệnh nhân suy giảm (ví dụ: mắc bệnh do virus)
- Niêm mạc và mô của bệnh nhân bị tổn thương (bị phỏng, bị loét do nằm lâu ngày)
- Dùng corticoid lâu ngày
- Sử dụng các dụng cụ y khoa: thông tiểu bằng ống thông (sonde), gây mê, đặt nội khí quản, rút nước dịch não tủy, mở thông khí quản, chích thuốc
- Hóa trị, xạ trị ung thư làm giảm tính miễn dịch của bệnh nhân - Làm dụng kháng sinh, tiêu diệt hết vi khuẩn thường trú ở ruột
Ngày nay, vi khuẩn này được xem là nguyên nhân chủ yếu của các trường hợp nhiễm khuẩn ở bệnh nhân nằm viện lâu ngày Người ta gọi đó là bệnh nhiễm khuẩn mắc phải ở bệnh viện (hospital – acquired infections) (Nguyễn Thanh Bảo, 2011)
Việc nhiễm P aeruginosa ngày càng trở nên quan trọng là do sự đề kháng thuốc rất mạnh của vi khuẩn này đối với kháng sinh Nguồn lây vi khuẩn P aeruginosa cho
người là môi trường ẩm thấp ở bệnh viện Người mang mầm bệnh tiềm ẩn là nguồn lây quan trọng từ người này sang người khác (Đoàn Thị Nguyện, 2012)
I.1.3 Phòng ngừa và điều trị
Trang 20I.2 NHIỄM TRÙNG BỆNH VIỆN
I.2.1 Khái niệm
Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO): “Nhiễm trùng bệnh viện là những nhiễm trùng mắc phải trong thời gian điều trị tại bệnh viện mà tại thời điểm nhập viện hoặc trước đó không thấy có yếu tố nhiễm khuẩn hay ủ bệnh nào Nhiễm trùng 48 giờ sau khi nhập viện thường được coi là nhiễm trùng bệnh viện” (Đặng Đức Anh, 2010)
Được chia thành 2 loại chính đó là:
+ Nhiễm trùng nội sinh (nhiễm trùng cơ hội): là nhiễm trùng do vi sinh vật có sẵn trên cơ thể bệnh nhân
+ Nhiễm trùng ngoại sinh: là nhiễm trùng do vi sinh vật bên ngoài cơ thể xâm nhập và gây bệnh
I.2.2 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa gây nhiễm trùng bệnh viện
Trong các tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện, vi khuẩn P aeruginosa là một
trong số vi khuẩn được đề cập đến nhiều nhất do tính chất trầm trọng của bệnh, vì tác động cực mạnh bởi độc lực của chúng và khả năng đa kháng thuốc của vi khuẩn này
Trong nhiễm trùng bệnh viện thường gặp vi khuẩn P aeruginosa trong các bệnh nhiễm
trùng vết mổ, vết thương, do tai nạn lao động, tai nạn giao thông, nhiễm trùng da (nhiễm trùng vết bỏng), nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng huyết (Baltch và cs., 1994).
I.3 KHÁNG SINH
I.3.1 Định nghĩa
Kháng sinh (antibiotic) là những chất ngay ở nồng độ thấp đã có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật một cách đặc hiệu (mỗi kháng sinh chỉ tác động lên một vi khuẩn hay một nhóm vi khuẩn) bằng cách gây rối loạn phản ứng sinh vật ở cấp độ phân tử (Lê Huy Chính, 2003)
I.3.2 Phân loại
Trang 21Dựa trên sự liên quan về cấu tạo hóa học, đưa đến sự liên quan về cơ chế và hoạt
phổ tác dụng, kháng sinh được chia thành 2 nhóm lớn: β-lactams và non β-lactams
(Okon KO, Agukwe PC, 2009)
- β-lactams: Gọi là β-lactams vì phân tử của chúng có một vòng β-lactams Cơ
chế tác động chung là ức chế tổng hợp vách của tế bào vi khuẩn
I.3.3 Kháng sinh Carbapenem và enzyme carbapenemase
I.3.3.1 Kháng sinh Carbapenem
Kháng sinh Carbapenems là một phân lớp của lớp Penem thuộc nhóm kháng sinh
β-lactams có phổ kháng khuẩn rộng nhất so với các phân lớp khác của β-lactams
Carbapenem đóng một vai trò quan trọng trong nguồn kháng sinh để chống lại các vi khuẩn Gram âm và Gram dương Chúng thường được sử dụng như là vũ khí hữu hiệu cuối cùng đối với những bệnh nhân nhiễm khuẩn nặng hoặc các kháng sinh khác đã bị vô hiệu hoá hoặc không phù hợp Carbapenem có cấu trúc gần giống penicillin, gồm 1
vòng β-lactam hình vuông nối kết với 1 vòng 5 cạnh, nhưng khác với penicillin ở chỗ
nguyên tố lưu huỳnh thay bằng gốc methylen và có thêm đầu nối đôi (Papp-Wallace và cs., 2011)
Nghiên cứu biến đổi cấu trúc hóa học của penicillin và cephalosporin đã tạo thành
một nhóm kháng sinh β – lactam mới, có phổ kháng khuẩn rộng, đặc biệt có hoạt tính
rất mạnh trên vi khuẩn Gram (-), đó là kháng sinh nhóm carbapenem Nhóm carbapenem gồm các kháng sinh: imipenem, meropenem, doripenem, ertapenem (Bộ Y tế, 2015)
I.3.3.2 Enzyme carbapenemase
Enzyme carbapenemase là enzym thuộc họ β – lactamase bất hoạt được tất cả các
loại β – lactam như pencillin, cephalosporin phổ rộng và kể cả kháng sinh mạnh nhất hiện nay là carbapenem, vũ khí kháng sinh duy nhất giúp các bác sĩ điều trị chỉ định nhiễm khuẩn do vi khuẩn tiết ESBL (Queenan và cs, 2007; Phạm Hùng Vân, 2013) Carbapenemase phá hủy được carbapenem với nguồn gốc gen nằm trên plasmid hay
Trang 22integron của nhiễm sắc thể do vậy mà có khả năng lây lan cao Các carbapenemase hiện nay đã xuất hiện ở nhiều nơi trên thế giới và đang được xem là “ác mộng” đề kháng kháng sinh đối với con người (Phạm Hùng Vân, 2013) Có hai loại
carbapenemase được cảnh báo gần đây, đó là blaKPC và NDM - 1 KPC là một loại β – lactamase lớp A nguồn gốc plasmid phát hiện trên K pneumoniae, lưu hành ở Hoa Kỳ,
Nam Mỹ và Châu Âu và hiện cũng lây lan ra một số loài khác (Yigit và cs, 2001)
NDM - 1 được cảnh báo là nguy hiểm nhất vì lan truyền cao, thuộc lớp B, metallo - β – lactamase, nguồn gốc plasmid và intergon được phát hiện trên K pneumoniae và E
coli, lưu hành cao ở Ấn Độ, Pakistan (Yong và cs, 2009) Chính vì vậy, phát hiện chính
xác vi khuẩn tiết ra enzym này rất quan trọng để cảnh báo nguy cơ lây lan tính đề
kháng nguy hiểm này trong cộng đồng (Phạm Hùng Vân, 2013)
I.3.4 Cơ chế tác động của kháng sinh
Ức chế quá trình tổng hợp vách tế bào
Vách tế bào là mạng lưới các sợi peptidoglycan đan vào nhau nhờ liên kết pentapeptide tạo nên do hoạt động của các enzym peptidase có nhiệm vụ giữ hình dạng tế bào được nguyên vẹn trước áp lực thẩm thấu cao ở bên trong tế bào Khi sự tổng hợp vách tế bào bị ức chế do tác dụng của kháng sinh, các vi khuẩn Gram dương biến thành dạng hình cầu không có vách (protoplast) và các vi khuẩn Gram âm có vách không hoàn chỉnh (sphaeroplast), làm tế bào dễ bị vỡ ở môi trường trương lực bình thường (Nguyễn Thanh Bảo, 2011)
Kháng sinh ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn là kháng sinh đáp ứng tốt nhất nguyên tắc độc tính chọn lọc vì vách tế bào vi khuẩn là một cấu trúc đặc trưng chỉ hiện diện trên tế bào vi khuẩn mà không có trên các tế bào có nhân của con người hay các
sinh vật khác Do đó, cho đến nay, β – lactam là nhóm kháng sinh được phát triển và
đưa vào sử dụng nhiều nhất (Phạm Hùng Vân, 2013)
Ức chế chức năng của màng tế bào
Trang 23Màng tế bào chất là hàng rào có khả năng thẩm thấu chọn lọc, có chức năng vận chuyển chủ động và kiểm soát các thành phần ở bên trong màng tế bào Nếu chức năng màng tế bào chất bị phá vỡ thì những đại phân tử và những ion sẽ thoát khỏi tế bào (Nguyễn Thanh Bảo, 2011), đồng thời nước từ bên ngoài đi vào bên trong làm tế bào chết (Bộ Y tế, 2015) Với cơ chế tác động này, polymyxin có tác dụng diệt khuẩn tuyệt đối, tức là giết cả tế bào đang nhân lên và cả tế bào ở trạng thái nghỉ - không nhân lên (Bộ Y tế, 2015)
Như vậy, mỗi kháng sinh chỉ tác động lên một vị trí nhất định trong thành phần cấu tạo, ảnh hưởng đến một khâu nhất định trong các phản ứng sinh học khác nhau của tế bào vi khuẩn, dẫn đến ngừng trệ sinh trưởng và phát triển của tế bào Nếu vi khuẩn không bị ly giải hoặc không bị nắm bắt (thực bào) và tiêu diệt, thì khi không còn tác động của kháng sinh (ngừng thuốc) vi khuẩn sẽ có thể hồi phục / sống trở lại Chỉ cần 1 tế bào sống sót, với tốc độ sinh sản nhanh chóng, sau vài giờ số lượng tế bào vi khuẩn đã không đếm được, sẽ nguy hiểm hơn nữa nếu tế bào sống sót đó đề kháng kháng sinh (Bộ Y tế, 2015)
Ức chế tổng hợp protein
Tham gia sinh tổng hợp protein ngoài ribosome còn có các ARN thông tin và các ARN vận chuyển Điểm tác động là ribosome 70S của vi khuẩn: tại tiểu phần 30S ví dụ như aminoglycosid (nơi ARN thông tin trượt qua), tetracyclin (nơi ARN vận chuyển mang acid amin tới) hoặc tại tiểu phần 50S (nơi acid amin liên kết tạo polypeptid) như erythromycin, cloramphenicol, clindamycin Kết quả là các phân tử protein không
Trang 24được hình thành hoặc được tổng hợp nhưng không có hoạt tính sinh học làm trì hoãn quá trình sinh trưởng và phát triển (Bộ Y tế, 2015)
I.3.5 Cơ chế đề kháng kháng sinh
Kháng sinh có bốn cơ chế tác động lên bốn cấu trúc sống còn của vi khuẩn để gây ra hiệu quả diệt khuẩn hay kìm khuẩn Để đối kháng lại, vi khuẩn có bốn cơ chế giúp chúng đề kháng lại tác động của kháng sinh (Phạm Hùng Vân, 2013)
- Làm giảm tính thấm của vách/màng ngoài và màng bào tương nên kháng sinh không thấm được vào tế bào vi khuẩn, ví dụ đề kháng tetracyclin, oxacilin hoặc làm mất 56 khả năng vận chuyển qua màng như đề kháng streptomycin hoặc/và tăng hoạt động của hệ thống bơm (efflux) đẩy kháng sinh ra khỏi tế bào
- Thay đổi đích tác động nên kháng sinh không gắn được vào đích để phát huy tác dụng, ví dụ đề kháng streptomycin, erythromycin do thay đổi ở ribosom; thay đổi đích gắn penicillin - penicillin binding proteins (PBPs) dẫn đến đề kháng beta-lactam
- Thay đổi con đường trao đổi chất do tạo ra isoenzym, không có ái lực với kháng sinh nữa, ví dụ đề kháng sulfamid, trimethoprim
- Tạo ra enzym để biến đổi cấu trúc phân tử kháng sinh hoặc enzym phá hủy cấu trúc phân tử kháng sinh như các beta-lactamase (Bộ Y tế, 2015)
I.4 SƠ LƯỢC TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SỰ KHÁNG KHÁNG
SINH CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRÊN THẾ GIỚI VÀ
TRONG NƯỚC
I.4.1 Trong nước
Theo “Báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện Việt
Nam năm 2008-2009” của Bộ Y tế, tỷ lệ kháng kháng sinh của P aeruginosa khác
nhau giữa các loại kháng sinh được xét nghiệm và giữa các bệnh viện Bệnh viện Xanh Pôn, bệnh viện đa khoa tuyến tỉnh thuộc khu vực phía Bắc có tỷ lệ kháng Ceftazidime
cao nhất với hơn 80%, ngược lại chỉ có 20% các chủng P aeruginosa kháng
Trang 25Ceftazidime được ghi nhận tại Bệnh viện Phổi Trung ương Bệnh viện này cũng cho kết quả tỷ lệ kháng Ciprofloxacin thấp với khoảng 20%, tương tự hai bệnh viện nhi: Bệnh viện Nhi Trung ương (phía Bắc) là 18% và Bệnh viện Nhi đồng I (phía Nam) là 19% Các bệnh viện còn lại có mức độ kháng dao động nhẹ khoảng 40% với
Ceftazidime và Ciprofloxacin Nhìn chung, tỷ lệ kháng với Imipenem của các chủng P
aeruginosa cao hơn so với các chủng Klebsiella Mức kháng Imipenem cao nhất được
ghi nhận ở bệnh viện Xanh Pôn là 43% và mức kháng thấp nhất ở bệnh viện Đồng Tháp là 3% (Nguyễn Văn Kính và cs., 2010)
Năm 2008, Bùi Khắc Hậu cùng nhóm tác giả đã tiến hành phân lập trên một số bệnh phẩm nhiễm trùng bệnh viện ở 4 bệnh viện: Việt Đức, Bệnh viện 108, Bệnh viện
Xanh Pôn và bệnh biện 103 (Viện Bỏng), kết quả thu được tỷ lệ P aeruginosa kháng
với Tetracyclin chiếm tỷ lệ cao nhất (92,1%), tiếp đến là Ceftriaxon (58,9%), Gentamycin (54,3%) và Cefotaxim (53,2%), tỷ lệ kháng với Imipenem thấp (16,4%) (Bùi Khắc Hậu và cs., 2008)
Từ 05/2008 đến 11/2009, Phạm Hùng Vân và nhóm nghiên cứu MIDAS đã nghiên cứu đa trung tâm về tình hình đề kháng Imipenem và Meropenem của trực khuẩn Gram âm dễ mọc, kết quả trên 16 bệnh viện tại Việt Nam, một trong những kết
quả thu được: P aeruginosa kháng với Meropenem và Imipenem với tỷ lệ lần lượt là
15,4% và 20,7% (Phạm Hùng Vân và cs., 2010)
Năm 2008 – 2009, Trương Anh Thư đã khảo sát “Đặc điểm dịch tễ học nhiễm khuẩn phổi bệnh viện tại khoa Hồi sức tích cực Bệnh viện Bạch Mai”, kết quả thu
được: trong số các tác nhân gây nhiễm khuẩn viêm phổi bệnh viện: Acinetobacter
baumannii chiếm 44,7%, Candida spp chiếm 19,7% và P aeruginosa chiếm 17,4%
Theo dẫn liệu cũng cho thấy P aeruginosa đã đề kháng với mọi kháng sinh thử
nghiệm với tỷ lệ kháng khá cao, từ 57,9% đến 84,2% (Trương Anh Thư, 2009 )
Từ 01/01/2010 đến 30/06/2010, Bùi Nghĩa Thịnh và cộng sự đã “Khảo sát tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn tại khoa Hồi sức tích cực và chống độc bệnh
Trang 26bệnh viện P aeruginosa chiếm 7,7% và tỷ lệ kháng kháng sinh với
Imipenem/Cilastatin khá cao lên tới 50%, trong khi đó Meropenem là 18,2% Một điều đặc biệt là Ceftazidime và Cefepime có mức kháng khá thấp với tỷ lệ lần lượt là 11,1% và 10% (Bùi Nghĩa Thịnh và cs., 2010) Từ năm 2010 – 2011, Trần Huy Hoàng nghiên cứu “Một số đặc điểm dịch tễ học của nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn kháng Carbapenem mang gen NDM-1 tại bệnh viện Việt Đức-Hà Nội” Kết quả nghiên cứu đã đưa ra được bằng chứng đầu tiên về sự có mặt của vi khuẩn kháng Carbapenem
“kháng sinh mạnh nhất hiện nay” mang gen blaNDM-1 tại Việt Nam Đây là vấn đề cực kỳ nghiêm trọng và là thách thức lớn đối với ngành y tế Việt Nam (Trần Huy Hoàng, 2011 )
Từ năm 2010-2012, Trần Thanh Nga đã khảo sát “Tác nhân gây viêm phổi và khuynh hướng đề kháng kháng sinh 2010 – 2012 tại Bệnh viện Chợ Rẫy”, kết quả thu
được: các tác nhân chủ yếu gây nhiễm khuẩn hô hấp là Acinetobacter baumannii (43,6%), Klebsiella sp (15,2%), Staphylococcus aureus (10,5%) và P aeruginosa (11,1%) Khảo sát kháng sinh đồ cho kết quả: P aeruginosa kháng Colistin (5%),
Piperacillin/Tazobactam (20%), Sulbactam/Cefoperazone (28%), Meropenem, Imipenem (31%) (Trần Thanh Nga, 2013)
Năm 2013, Nguyễn Thị Vân và cộng sự đã “Nghiên cứu tình hình nhiễm và mức
độ nhạy cảm kháng sinh của Acinetobacter baumannii và P aeruginosa tại khoa Hồi sức tích cực Bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức”, cho kết quả: trong 93 chủng P
aeruginosa, có 97,8% số chủng còn nhạy cảm với Colistin, 91,3% nhạy cảm với
Piperacillin/Tazobactam, 38,7% nhạy cảm với Ciprofloxacin, 68, 5% nhạy cảm với Amikacin, 35,5% nhạy cảm với Gentamicin, 35,6% nhạy cảm với Netilmicin, 65,9% nhạy cảm với Imipenem, 37,6% nhạy cảm với Meropenem và còn nhạy cảm 39,8% với Ceftazidime (Nguyễn Thị Vân và cs., 2013)
Trang 27I.4.2 Trên thế giới
Năm 2002, Paul D Brown và Anicetus Izundu phân lập được các chủng P
aeruginosa kháng cao nhất với Cefaclor (100% các chủng phân lập), Acid nalidixic
(82,4%), Amikacin (76,5%), và Trimethoprim / sulfamethoxazole (56,9%) Tỉ lệ đề kháng là 25,5% hoặc thấp hơn cho Tobramycin, Gentamicin, Polymyxin B, Cefotaxime, Ciprofloxacin, Norfloxacin, Niperacillin và Carbapenems (Paul D Brown và cs., 2002)
Năm 2002, T L Pitt và cộng sựđã thu được 38% số mẫu phân lập đều mẫn cảm với tất cả các kháng sinh được kiểm tra; gần 50% kháng với Gentamicin, Ceftazidime (39%), Piperacillin (32%), Ciprofloxacin (30%), Tobramycin (10%), và Colistin (3%)
Khoảng 40% số chủng P aeruginosa kháng với hai hoặc nhiều hơn các hợp chất với
Ceftazidime kết hợp với Gentamicin, Piperacillin hay Ciprofloxacin là kháng chéo phổ biến nhất Tỷ lệ đề kháng nói chung tương tự như những báo cáo gần đây từ Mỹ và Đức (T L Pitt và cs., 2003)
Năm 2006, Maria Virginia Villegas và cộng sự đã xác định được 3 chủng P
aeruginosa phân lập có mức đề kháng cao với Carbapenem (MIC ≥ 256), kết quả phản
ứng PCR đã xác định được vị trí của gene blaKPC-2 trên plasmid Đây là báo cáo đầu tiên về enzyme KPC loại β-lactamase được sản xuất bởi P aeruginosa KPC là enzyme
thủy phân các kháng sinh Carbapenem được sản xuất chủ yếu bởi vi khuẩn họ
Enterobacteriaceae (Maria Virginia Villegas và cs., 2007)
Năm 2009, Okon KO và cộng sự phân lập từ 106 chủng P Aeruginosa biết được độ tuổi nhiễm P aeruginosa chủ yếu từ 20-29 tuổi và tỷ lệ nhiễm ở nam là 52,8%, ở
nữ là 47,2% Đa số các chủng vẫn còn nhạy với Sparfloxacin (84,9%), tiếp theo là Ciprofloxacin (69,8%), Pefloxacin (52,8%), Ceufuroxime (49,1%) và Ceftriazone (13,2%) (Okon KO và cs., 2009)
Năm 2011, Anis Karuniawati và cộng sự thu được các chủng P aeruginosa kháng Carbapenem là 21,9% và có 5% số chủng P aeruginosa mang gen blaIPM1 được
Trang 28phân lập từ đàm, không phát hiện các chủng nào mang gen blaKPC-2, blaVIM2, blaOXA-48 và blaNDN-1 (Anis Karuniawati và cs., 2011)
Từ tháng 1/2012 đến tháng 6/2012, Chander Anil và Raza Mohamad Shahid thu
được các chủng P aeruginosa được phân lập từ các bệnh phẩm là đàm, mủ, nước tiểu
và dịch hút khí quản Kết quả khảo sát kháng sinh cho thấy số chủng kháng với Amikacin (17,25%), Ciprofloxacin (27,59%) và Cefoperazone-sulbactam (34,48%) Tỷ lệ đề kháng với Co-trimoxazole, Piperacillin, Ceftriaxone và Chloramphenicol dao động từ 51% đến 73% Tất cả các chủng phân lập đều nhạy cảm với Imipenem,
20,69% các chủng P aeruginosa là đa kháng thuốc (Chander Anil và cs., 2013)
Năm 2013, Somayeh Moazami-Goudarzi và cộng sự đã phân lập được các chủng
P aeruginosa từ bệnh phẩm là vết thương (88,7%), tiếp theo là 5,26% từ máu, 1,5% từ
nước tiểu Kết quả khảo sát kháng sinh đồ cho thấy 99,2% kháng Carbenicillin, 98,4% kháng Ticarcillin, 96,2% kháng với Ciprofloxacin, 95,4% kháng CoTrimoxazole, 94,7% kháng Imipenem và Meropenem, 93,9% kháng Piperacillin, 93,2% kháng Aztreonam, 92,4% với Tobramycin, 91,7% kháng Cefepime, 89,4% kháng Amikacin và Ceftazidime Nhìn chung, các chủng để là vi khuẩn đa kháng thuốc (kháng ≥ 3 kháng sinh) (Somayeh Moazami-Goudarzi và cs., 2013)
Năm 2013, Mahnaz Sarhangi và cộng sự đã phân lập được 82 chủng P
aeruginosa chiếm (34,16%) số chủng P aeruginosa kháng Carbapenem là 21,9% và có
5% số chủng P aeruginosa mang gen blaIPM1 được phân lập từ đàm, không phát hiện
các chủng nào mang gen blaKPC-2, blaVIM2, blaOXA-48 và blaNDN-1 (Mahnaz Sarhangi và cs., 2013)
Qua các kết quả về các nghiên cứu trong và ngoài nước về sự đề kháng kháng
sinh của P aeruginosa, chúng tôi nhận thấy có sự gia tăng về khả năng kháng kháng sinh của P aeruginosa qua các năm và mức độ kháng là khác nhau phụ thuộc vào vị trí
địa lý, địa điểm, thời gian và đối tượng nghiên cứu Nhiều cơ chế đề kháng kháng sinh
của P aeruginosa cũng đã được phát hiện và làm rõ, đặc biệt là xác định được các
Trang 29PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trang 30II.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
- Thời gian: từ tháng 02/2019 đến tháng 4/2019
- Địa điểm: khoa Xét nghiệm Vi sinh - bệnh viện Nhi Đồng 1 TP Hồ Chí Minh
II.2.1 Vật liệu nghiên cứu
Vi khuẩn trong nghiên cứu này là tất cả vi khuẩn P aeruginosa được phân lập từ
các bệnh phẩm khác nhau của các khoa lâm sàng gửi tới khoa Vi sinh trong thời gian 1/3/2018 đến 28/2/2019
II.2.2 Môi trường
II.2.2.1 Môi trường nuôi cấy phân lập
Blood Agar (thạch máu cừu – BA): là môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy phân lập các vi khuẩn từ tất cả các mẫu bệnh phẩm trừ mẫu phân
Mac Conkey Agar (MC): là môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy, phân lập các trực khuẩn Gram âm dễ mọc
Muller Hinton Agar (MHA): là môi trường tốt nhất để thử nghiệm kháng sinh đồ thường quy Thích hợp tăng trưởng cho hầu hết các vi khuẩn dễ mọc
II.2.2.2 Môi trường thực hiện phản ứng sinh hóa
Môi trường Kligler Iron Agar (KIA) thử khả năng sử dụng các nguồn
cacbonhydrat, sinh hơi
Môi trường Simmon’s citrate thử khả năng sử dụng nguồn citrate như nguồn cacbon duy nhất
Sim Medium (SIM): môi trường chuyên biệt để khảo sát khả năng sinh H2S, Indol và khả năng di động của vi khuẩn
II.2.3 Đĩa kháng sinh
Đĩa kháng sinh là những đĩa giấy có đường kính 6 mm, được tẩm dung dịch kháng sinh với nồng độ tiêu chuẩn Các đĩa kháng sinh được đóng gói đảm bảo điều kiện hút ẩm và được lưu giữ ở 2 - 80C hoặc ở -140C
Trang 31Có rất nhiều loại kháng sinh Tuy nhiên không thể thử nghiệm kháng sinh đồ hết cho tất cả các loại mà cần phải có sự lựa chọn
Các tiêu chuẩn lựa chọn kháng sinh thử nghiệm được hướng dẫn chi tiết bởi Ủy ban Quốc gia về tiêu chuẩn của các phòng thí nghiệm tại Mỹ (Clinical Laboratory Standards Institute, CLSI) Các tiêu chuẩn chính là:
- Chọn kháng sinh đại diện cho nhóm có cùng phổ hoạt động
- Tùy thuộc vào loại vi khuẩn thử nghiệm
- Tùy thuộc vào vị trí nhiễm khuẩn
- Tùy theo chiến lược và chính sách sử dụng kháng sinh ở từng vùng, từng địa phương
Bảng 2.1 : Quy định đặt đĩa kháng sinh đồ
AZ
CIP
FEP
CTX
GEN
I PM
MEM
TTC
LEV
SXT
TRỰC KHUẨN GRAM (-) (oxidase +)
* * * * * * * * * *
Hình 2.1 : Thử kháng sinh trên môi trường MHA
(Ảnh chụp tại bệnh viện)
Trang 32II.2.4 Sinh phẩm, hóa chất và thuốc thử
- Nước muối sinh lý: NaCl 0,85% - Oxidase, bộ thử nghiệm sinh hóa - Dầu soi kính hiển vi
- Crystal violet, lugol, alcohol – acetol, dung dịch fuchsin 0,5%
II.2.5 Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: - Tủ lạnh - Tủ CO2
- Tủ cấy (an toàn sinh học cấp II) - Tủ ấm
- Máy ly tâm - Máy cấy máu - Máy tính
- Máy nhuộm lam - Kính hiển vi Dụng cụ: - Găng tay - Khẩu trang - Lọ đựng mẫu - Lame
- Que cấy nhựa - Que cấy định lượng - Đèn cồn
- Đĩa petri - Ống nghiệm - Giá ống nghiệm