Đang tải... (xem toàn văn)
KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO Solanum procumbens L....472.1 Kết quả khảo sát khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của các chủng
Trang 1- ∞0∞ -
DƯƠNG NGỌC LINH
KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VI KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO
(Solanum procumbens Lour)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ∞0∞ -
Giảng viên hướng dẫn: ThS DƯƠNG NHẬT LINH
Trang 3TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
GIẤY XÁC NHẬN
Tôi tên là : Dương Ngọc Linh
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Y-Dược Mã học viên: 1853010074 Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho
Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh
Ký tên
(Ghi rõ họ và tên)
Dương Ngọc Linh Ngày sinh: 29/02/2000 Nơi sinh: Kiên Giang
Trang 4Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN
Giảng viên hướng dẫn: ThS DƯƠNG NHẬT LINH
Học viên thực hiện: DƯƠNG NGỌC LINH Lớp:DH18YD01
Ngày sinh: 29-02-2000 Nơi sinh: Kiên Giang
Tên đề tài: “KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VI KHUẨN NỘI SINH
CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens Lour)”
Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên:
được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng:
Trang 5LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô và Ban giám hiệu khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã dạy em những kiến thức chuyên ngành nền tảng và bài học làm người trong cuộc sống, đã hỗ trợ trang thiết bị tạo điều kiện cho em để có thể hoàn thiện đề tài
Em xin gửi đến cô Dương Nhật Linh, thầy Nguyễn Văn Minh lòng biết ơn sâu sắc vì đã hỗ trợ em trong việc lựa chọn đề tài, đã tận tình chia sẻ kiến thức chuyên
ngành và cả những bài học trong cuộc sống Trong quá trình học việc tại phòng thí nghiệm Vi sinh, thầy cô đã truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, tiếp thêm động lực để em hoàn thành tốt đề tài
Em cảm ơn cô Nguyễn Tiến Linh và chị Trần Thị Á Ni đã đồng hành, hỗ trợ và chỉ dẫn nhiệt tình để em hoàn thiện bài báo cáo Em cảm ơn anh Nguyễn Hoàng
Minh đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài một cách an toàn trong tình
hình dịch bệnh hiện nay Cảm ơn, chị Nguyễn Thị Thanh Nguyệt, bạn Phan Thị
Mỹ Long đã bên cạnh, động viên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài
Em xin gửi lời cảm ơn đến các bạn trong phòng thí nghiệm Vi Sinh và Tế bào trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã luôn hỗ trợ em
Con xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Ba mẹ đã sinh ra con, đã dạy cho
con nhiều điều hay, lẽ phải và gia đình luôn là chỗ dựa vững chắc giúp con lấy lại động lực mỗi khi thất bại hay vấp ngã, luôn tạo điều kiện tốt nhất để con hoàn thành mong muốn và công việc của mình
Cuối cùng, em xin kính chúc tất cả quý thầy cô, các anh chị, bạn bè các em và gia đình nhiều sức khỏe, bình an và thành công trong cuộc sống
Em xin chân thành cảm ơn!
Bình Dương, ngày 29 tháng 09 năm 2022
Dương Ngọc Linh
Trang 6PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14
1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens Lour)… 15
1.1 Phân loại khoa học 15
1.2 Đặc điểm hình thái 15
1.3 Phân bố, thu hái và chế biến 16
1.4 Thành phần hóa học 16
1.5 Tác dụng dược lý 19
2 SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN NỘI SINH 19
2.1 Vi khuẩn nội sinh 19
2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước 20
3 TỔNG QUAN VỀ CÁC VI KHUẨN GÂY BỆNH THÔNG THƯỜNG 23
3.1 Vi khuẩn Escherichia coli 23
3.2 Pseudomonas aeruginosa 24
3.3 Salmonella typhi 25
3.4 Staphylococcus aureus 25
3.5 Vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) 26
4 TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI NẤM GÂY BỆNH… 27
4.1 Trichophyton rubrum 27
4.2 Microsporum canis 27
Trang 7PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
1 VẬT LIỆU 30
1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 30
1.2 Đối tượng nghiên cứu 30
1.3 Thiết bị và dụng cụ, hóa chất và môi trường 30
3.2.3Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn nội sinh 36
3.3 Định danh chủng vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) có hoạt tính sinh học tiềm năng nhất 34
PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38
1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ LÀM THUẦN VI KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.)… 39
1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo 39
1.2 Kết quả làm thuần và quan sát đại thể, vi thể 44
2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens L.) 47
2.1 Kết quả khảo sát khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của các chủng vi khuẩn nội sinh từ cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) 47
Trang 82.1.1Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn nội sinh 472.1.2Kết quả khảo sát khả năng kháng vi nấm gây bệnh của các chủng vi khuẩn nội sinh 52
2.2 Kết quả khảo sát khả năng tiêu huyết của các chủng vi khuẩn nội sinh cây
cà gai leo (Solanum proumbens L.) 56
2.3 Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào từ các chủng vi khuẩn
nội sinh (Solanum proumbens L.) 58
2.4 Kết quả định danh sinh học phân tử vi khuẩn nội sinh (Solanum
proumbens L.) có hoạt tính sinh học mạnh nhất 62
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 661 KẾT LUẬN 67
2 KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69
Tài liệu tiếng Việt 69Tài liệu tiếng Anh 70Nguồn internet 76
PHỤ LỤC 77
Trang 9DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Cây cà gai leo (Solanum procumbens Lour) 12
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của steroidal alkaloid (1) và pregnane steroid (2) (Adam và cs., 1978; Adam, Huong H.T và cs., 1978) 16Hình 1.3 Ziganein (1), benzoic acid (2), saliyli acid (3), 4-hydroxybenzaldehyde (4), anillic acid (5) và indole-3-carbaldehyde (6) (Adam và cs., 1978; Adam, Huong H.T và cs., 1978) 17Hình 1.4 Solaprocumoside A (1), solaprocumoside B (2) và paniculonin B (3) (Hien và cs., 2018) 17Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của 8,3′-neolignan (Nguyen và cs.,2021) 18Hình 1.6 Dioscin (1), β-sitosterol (2), daucosterol (3) và 6’-O-acetyl-β-daucosterol (4) (Nguyen và cs., 2021) 18
Hình 1.7 Vi thể của E coli dưới vật kính 100X (wikipedia) 19
Hình 1.11 Vi thể của MRSA dưới vật kính 100X (wikipedia) 20
Hình 1 12 Hình vi thể T rubrum quan sát dưới vật kính 40X (https://
vi.wikipedia.org/wiki/ Trichophyton rubrum) 20
Hình 1.13 Hình vi thể M canis quan sát dưới vật kính 40X (https://
vi.wikipedia.org/wiki/ Microsporum canis) 21
Hình 1.14 Hình vi thể T mentagrophytes quan sát dưới vật kính 40X (https://
Trang 10Hình 3.4 Kết quả quan sát kính vi thể các chủng vi khuẩn nội sinh 43 Hình 3.5 Kết quả làm thuần các chủng vi khuẩn nội sinh 43 Hình 3.6 Kết quả đánh giá khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo 48 Hình 3.7 Kết quả đánh giá khả năng kháng nấm bệnh của vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo 55 Hình 3.8 Kết quả đánh giá khả năng tiêu huyết của vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo 57 Hình 3.9 Kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo 60 Hình 3.10 Kết quả BLAST trên NCBI của chủng vi khuẩn nội sinh T3M2 61 Hình 3.11 Kết quả xây dựng cây phát sinh phân tử Neighbor-joining method 62 Hình 3.12 Kết quả xây dựng cây phát sinh phân tử Maximum Parsimony method63 Hình 3.13 Kết quả xây dựng cây phát sinh phân tử Maximum Parsimony method63
Trang 11DANH MỤC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
Bảng 2.1 Quy trình xử lý mẫu 29Bảng 3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo 39 Bảng 3.2 Kết quả quan sát đại thể, vi thể vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo 42 Bảng 3.3 Kết quả sàng lọc khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của 19 chủng vi khuẩn nội sinh từ cây cà gai leo 46 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây cà gai leo 47 Bảng 3.5 Kết quả sàng lọc khả năng kháng nấm gây bệnh của chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây cà gai leo 52 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm gây bệnh của chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây cà gai leo 53 Bảng 3.7 Kết quả khảo sát khả năng tiêu huyết của chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây cà gai leo 52Bảng 3.8 Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào từ chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây cà gai leo 58 Bảng 3.9 Thông tin kết quả dò tìm mô hình tiến hóa 61
Sơ đồ 2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 28
Trang 12DANH MỤC VIẾT TẮT
Cs: cộng sự
MRSA: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
CDC: Trung tâm Kiểm soát và phòng ngừa Dịch bệnh Hoa Kỳ
S procumbens: Solanum procumbens
IAA: Indole Acetic Acid
S aureus: Staphylococcus aureus
NA: Nutrient Agar NB: Nutrient Broth TSA: Tryptone Soya Agar MHA: Mueller Hinton Agar
PBS: Phosphate Bufferd Saline (đệm phosphat) CFU: Colony Forming Units (đơn vị khuẩn lạc) TNHH: Trách nhiệm hữu hạn
NCBI: National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
SD: Standard Deviation
Trang 13ĐẶT VẤN ĐỀ
Việc sử dụng các sản phẩm tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật trong điều trị đang thu hút nhiều sự chú ý do tiềm năng hiệu quả và không có tác dụng phụ (Subramani và cs., 2017) Được biết đến là một loài cây có nhiều công dụng chữa bệnh, cà gai leo
(Solanum procumbens Lour) thuộc họ cà (Solanaceae) từ xưa dân gian sử dụng rễ và
trái trị mụn nhọt, lở, phong thấp (Hộ và cs., 2003) Trong cây cà gai leo có chứa các hợp chất tự nhiên như alkaloid, triterpenoid, steroid và hợp chất polyphenol; ngoài ra, còn chứa các hoạt tính sinh học như kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng oxy hóa
và kháng viêm (Nguyen và cs., 2021) Các hợp chất phân lập từ cà gai leo (Solanum
procumbens L.) rất đa dạng trong đó có 6'-O-acetyl-β-daucosterol được cho là có khả
năng ức chế enzyme α-glucosidase hỗ trợ trong điều trị đái tháo đường (Nguyễn Xuân Hải và cs., 2018; Nguyen và cs., 2021) Tuy nhiên, việc thu nhận hợp chất từ dược liệu còn nhiều hạn chế Việc trồng cây dược liệu còn có hạn chế về yếu tố thời tiết, sâu bệnh và kỹ thuật canh tác Trong khi đó vi sinh vật có một số ưu điểm so với thực vật và động vật, chúng dễ dàng nuôi cấy và duy trì; có thể được sản xuất trong các quy trình lên men quy mô lớn và trở thành một nguồn thay thế cung cấp các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học quan trọng (Anjum và cs., 2019)
Vi sinh vật nội sinh là cộng đồng sinh vật sống trong các mô tế bào thực vật không gây hại tế bào mà còn thúc đẩy sự phát triển, cung cấp nguồn dinh dưỡng và bảo vệ cây ký chủ khỏi các tác nhân sinh học (Pandey và cs., 2016) ) Thành phần loài của quần thể nội sinh phụ thuộc vào kiểu gen, điều kiện môi trường, loại đất và giai đoạn sinh trưởng của cây ký chủ (Bonito và cs., 2014) Một số hợp chất chuyến hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học được sản xuất từ vi sinh vật nội sinh, có triển vọng lớn trong dược phẩm và các ngành công nghiệp khác (Falade và cs., 2021).Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu tập trung vào nấm và rất ít nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh (Nxumalo và cs., 2020).Vi khuẩn nội sinh được đặc trưng bởi khả năng sản xuất được nhiều hợp chất chuyển hóa thứ cấp, các tiềm năng như kháng nấm, kháng oxy hóa, kháng ung thư và các tiềm năng mới nổi như kháng sinh, kháng vi khuẩn kháng thuốc (Passari và cs., 2017; Singh và cs., 2018) Theo nghiên cứu của Singh và cộng sự
Trang 14(2020), một dòng vi khuẩn nội sinh mới từ cây Datura metesl tạo ra các chất chuyển
hóa thứ cấp kháng những chủng vi khuẩn kháng thuốc như Methicillin-resistant
Staphylococcus aureus (MRSA) (Singh và cs., 2020) Ntabo và cộng sự (2018), đã
phân lập vi khuẩn nội sinh từ thực vật rừng ngập mặn Kenya và cho thấy chúng tạo ra protease, pectinase, cellulase, amylase và chitinase có giá trị công nghiệp (Ntabo và cs., 2018) Vi khuẩn nội sinh được nghiên cứu là có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, y học và các ngành công nghiệp khác : cải thiện sự phát triển của cây trồng, thúc đẩy khả năng chống lại căng thẳng sinh học và phi sinh học, sản xuất các hợp chất chuyển hóa có tiềm năng y học (Wu và cs., 2021) Theo nghiên cứu của Liu và
cộng sự (2014), trong số 34 vi khuẩn nội sinh được phân lập từ lá, rễ và củ của P
ternata, 5 chủng có khả năng tạo ra purine alkaloids giống như cây ký chủ, 2 chủng
trong số đó có khả năng thúc đẩy sự phát triển của P ternata (Liu và cs., 2015) Một nghiên cứu khác của Zhou và cộng sự (2016), về Atractylodes lancea một cây thuốc
cổ truyền là thành phần chính của nhiều loại thuốc nổi tiếng cho thấy vi khuẩn nội
sinh đã làm tăng hàm lượng sesquiterpenoid oxy trong cây A lancea (Zhou và cs., 2016) Sự đa dạng của vi khuẩn nội sinh, khả năng sản xuất các hợp chất chuyển hóa
thứ cấp và sự thích nghi với các điều kiện căng thẳng đã khiến vi khuẩn nội sinh trở thành một nguồn thích hợp và không giới hạn trong việc tạo ra các hợp chất thứ cấp mới, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, sản xuất thực phẩm và thuốc kháng sinh (Ek-
Ramos và cs., 2019) Qua đó, vi khuẩn nội sinh được coi là một nguồn tài nguyên
tiềm năng đối với các nhà nghiên cứu về vi sinh vật nhất là ở thời điểm hiện tại Đặc biệt, hiện nay chưa có công trình nào công bố về vi khuẩn nội sinh cây cà
gai leo (Solanum procumbens Lour) ở trong nước cũng như ngoài nước Việc xác
định các hoạt tính sinh học có trong loài cây này vẫn chưa có nhiều nghiên cứu và chuyên sâu Vì vậy, dựa vào những tiềm năng của các chủng vi khuẩn nội sinh thuộc họ cà (Solanaceae) cũng như hoạt tính sinh học của cây cà gai leo tôi tiến hành thực
hiện đề tài: “KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VI KHUẨN
NỘI SINH CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens Lour)”
Trang 15Mục tiêu tổng quát:
Khảo sát một số hoạt tính sinh học từ vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum
procumbens Lour)
Mục tiêu cụ thể:
- Phân lập chủng vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo (Solanum procumbens Lour)
- Khảo sát một số hoạt tính sinh học của các chủng vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo (hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và khả năng sinh enzym ngoại bào) - Định danh chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính sinh học tiềm năng
Trang 16PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Trang 171 SƠ LƯỢC VỀ CÂY CÀ GAI LEO (Solanum procumbens Lour)
1.1 Phân loại khoa học Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Solanales
Họ: Solanaceae
Chi: Solanum
Loài: Solanum procumbens Lour
Tên khoa học: Solanum procumbens Lour, Solanum hainanensen Hance
Tên thường gọi: Cà gai leo, cà gai dây, cà quýnh,
1.2 Đặc điểm hình thái
Cà gai leo là cây thân leo gỗ, sống nhiều năm, dài khoảng 1 m hoặc hơn Cà gai leo phân cành nhiều, cành lá tỏa rộng, thân phủ rất nhiều lông che chở và gai cong màu vàng, nhọn Thân non có màu xanh, thân già màu nâu xám Các lá đơn, mọc cách, hình bầu dục, gốc lệch; phiến lá có thùy nông không đều, dài 3-6 cm, rộng 2-5,5 cm, mặt trên xanh sẫm, mặt dưới nhạt, hai mặt đều phủ dầy lông che chở màu trắng và có gai ở gân lá, cuống lá dài 0,5-1 cm, có gai dài 4-5 mm Bộ rễ cọc, điển hình của cây hai lá mầm; rễ non có màu trắng với lớp lông hút phủ kín bề mặt, khi già chuyển nâu Cà gai leo có hoa màu trắng tím, mọc thành cụm chùm từ 2-11 hoa mọc ở ngoài kẽ lá, có 4 đài màu xanh, phủ đầy lông che chở; 4 thùy hình trái xoan nhọn; 4 nhị màu vàng Quả có dạng mọng, hình cầu, nhẵn, khi non màu xanh lá cây nhạt đến đậm, khi chín có màu đỏ tươi, đường kính 5-7 mm; cuống dài 1-1,5 cm, phủ đầy lông che chở, phình to ở phần sát quả Hạt cà gai leo hình thận, màu vàng, kích thước 2-3 mm, mỗi quả có từ 15-30 hạt (Phùng Thị Thu Hà và cs., 2017)
Hình 1.1 Cây cà gai leo (Solanum procumbens Lour)
Trang 181.3 Phân bố, thu hái và chế biến
Cà gai leo thường phân bố ở một vài nước nhiệt đới Châu Á như Trung Quốc, Lào, Campuchia và Việt Nam Tại nước ta, cây cà gai leo mọc ở nơi nhiều ánh sáng, lẫn trong các lùm bụi thưa, bãi hoang từ vùng núi thấp đến trung du và đồng bằng ven biển, chủ yếu ở Thanh Hóa, Quảng Ngãi, Bình Định, Có thể được nhân giống bằng hạt, giâm cành, cà gai leo có khả năng tái sinh từ các đoạn thân, cành và gốc sau khi bị chặt Thu hoạch rễ và cành lá quanh năm, rửa sạch, thái nhỏ, dùng tươi hay phơi khô, sấy khô
1.4 Thành phần hóa học
Các báo cáo hóa thực vật S procumbens cho thấy sự hiện diện của hợp chất
chính solasodine là một steroidal alkaloid và pregnane steroid (Adam và cs., 1978; Adam, Huong H.T và cs., 1978)
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của steroidal alkaloid (1) và pregnane steroid (2) (Adam và cs., 1978; Adam,
Huong H.T và cs., 1978)
Trang 19Năm 2018, Nguyễn Xuân Hải và cộng sự đã công bố 6 hợp chất là ziganein, benzoic acid, saliyli acid, 4-hydroxybenzaldehyde, vanillic acid và indole-3-carbaldehyde (Nguyễn Xuân Hải và cs., 2018)
Trong năm 2018, hai saponin steroid mới (solaprocumoside A, B) và một hợp chất được biết là paniculonin B được Trương Thị Thu Hiền cùng cộng sự của mình
phân lập từ các bộ phận trên không của S procumbens (Hien và cs., 2018)
Hợp chất 8,3′-neolignan mới có tên là solacanin A được phân lập thành công năm 2021 bởi Nguyễn Trung Nhân và cộng sự (Nguyen và cs.,2021)
Hình 1.3 Ziganein (1), benzoic acid (2), saliyli acid (3), 4-hydroxybenzaldehyde (4), anillic
acid (5) và indole-3-carbaldehyde (6) (Nguyễn Xuân Hải và cs., 2018)
Hình 1.4 Solaprocumoside A (1), solaprocumoside B (2) và paniculonin B (3) (Hien và cs., 2018)
Trang 20Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của 8,3′-neolignan (Nguyen và cs.,2021)
Theo nghiên cứu năm 2021 về thành phần hóa học của S procumbens, 4 hợp
chất được xác định là dioscin (1), β-sitosterol (2), daucosterol (3) và daucosterol (4), trong đó hợp chất 1, 3 và 4 lần đầu tiên được phân lập từ cây cà gai leo (Nguyen và cs., 2021)
6’-O-acetyl-β-Những nghiên cứu về cà gai leo (Solanum procumbens Lour) đa phần tập trung
vào thành phần hóa học và các hợp chất thứ cấp có trong cây, chủ yếu là steroid alkaoid, saponoside, flavonoside và tinh bột
Hình 1.6 Dioscin (1), β-sitosterol (2), daucosterol (3) và 6’-O-acetyl-β-daucosterol (4)
(Nguyen và cs., 2021)
Trang 211.5 Tác dụng dược lý
Các báo cáo chứng minh công dụng của S procumbens có từ rất sớm Kết quả
khảo sát sơ bộ của Nguyễn Bích Thu và cộng sự (2000), cho thấy dịch chiết glycoalkaloid toàn phần có hoạt tính chống oxy hóa mạnh (Nguyễn Bích Thu và cs., 2000)
Nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ gan của cà gai leo trên mô hình gây tổn thương gan bằng paracetamol ở chuột trắng của Trương Thị Thu Hiền và cộng sự (2018), cho thấy cao chiết methanol của cà gai leo có tác dụng giảm tổn thương gan (Trương Thị Thu Hiền và cs., 2018)
Gần đây, Kumar và cộng sự công bố một hợp chất chính trong cà gai leo là solasodine, một loại steroid alkaloid có khả năng kháng khuẩn, chống ung thư, gây độc tế bào, bảo vệ gan, (Kumar và cs., 2019)
Ngoài ra, S procumbens còn là một cây thuốc quý trong y học cổ truyền có tác
dụng trừ phong thấp, trừ ho, cầm máu, giảm đau
2 SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN NỘI SINH
2.1 Vi khuẩn nội sinh
Thuật ngữ “endophyte” được mô tả lần đầu tiên vào năm 1809 bởi nhà thực vật học người Đức Heinrick Friedrich Link như là một nhóm riêng biệt của các loại nấm ký sinh một phần sống trong thực vật (Link, 1809)
Năm 1866, Bary là người đầu tiên phân biệt giữa vi sinh vật nội sinh và mầm bệnh thực vật (Bary, 1866) Qua nhiều định nghĩa phát triển, năm 1997 một định nghĩa phổ biến về vi sinh vật nội sinh là những vi khuẩn có thể được phân lập từ mô thực vật đã được khử trùng bề mặt hoặc chiết xuất từ bên trong cây và không gây hại cho cây trồng được Hallmann và cộng sự mô tả từ thực tế (Hallmann và cs., 1997)
Đến năm 1998, Azevedo đã định nghĩa vi sinh vật nội sinh chủ yếu là nấm và vi khuẩn sống bên trong các bộ phận của thực vật như lá, thân, rễ và thường không gây hại cho cây ký chủ, đây là định nghĩa đầy đủ nhất về endophyte và được sử dụng đến hiện tại (Azevedo, 1998) Sau đó thuật ngữ này được Dutta và cộng sự mở rộng (2014), bao gồm vi nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn chi toàn bộ hoặc một phần vòng đời
Trang 22của chúng cư trú bên trong hoặc ngoài tế bào ở các mô khỏe mạnh của thực vật, thường không gây hại cho cây chủ (Dutta và cs., 2014)
Vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào mô qua rễ nảy mầm, rễ phụ, khí khổng hoặc từ những vị trí tổn thương Được tìm thấy trong toàn bộ cây ký chủ và giảm dần từ rễ, thân, lá (Anjum và cs., 2015)
Vi khuẩn nội sinh là nguồn thay thế các hợp chất có hoạt tính sinh học và chế phẩm sinh học do sự kháng thuốc ngày càng tăng của vi khuẩn gây bệnh đối với các loại kháng sinh hiện có (Strobel và cs., 2003)
Theo Rosenblueth và cộng sự (2006), vi khuẩn nội sinh thúc đẩy sự phát triển và năng suất của cây trồng, ngăn chặn mầm bệnh, có thể giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm, hòa tan phosphat, cố định nitơ cho cây trồng (Rosenblueth và cs., 2006)
Chiết xuất thô của vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây dược liệu được công nhận là nguồn có giá trị của các hợp chất hoạt tính sinh học mới với các hoạt động khác nhau như kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hóa, ứng dụng trong y học, nông nghiệp và các ngành công nghiệp khác (Makuwa và cs., 2021)
Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu tốt để chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học do chúng dễ phân lập, dễ phát triển và không có tác động tiêu cực đến môi trường và năng suất nông nghiệp (Pham cs., 2019)
2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước
Vi khuẩn nội sinh cây dược liệu là đề tài nghiên cứu đầy triển vọng trong việc phát hiện ra các chất chuyển hóa mới, nghiên cứu về các cây họ Solanaceae đang được quan tâm trong những năm gần đây
Năm 2012, phân lập thành công chủng vi khuẩn Streptomyces spp nội sinh cây
Datura stramonium L có khả năng sản xuất enzyme như amylase, lipase và
catalase;chất chuyển hóa được sản xuất từ Streptomyces spp cho kết quả kháng lại
nấm và khuẩn gây bệnh (VS và cs., 2012)
Năm 2015, chủng vi khuẩn Bacillus subtilis (BMP01) phân lậptừ lá Solanum
trilobatum L đã cho thấy khả năng sản xuất bacteriocins là các peptide kháng khuẩn
(Bhuvaneswari và cs., 2015)
Trang 23Năm 2017, Syed và cộng sự phân lập 3 vi khuẩn nội sinh rễ cây Capsicum annum kháng lại các chủng vi khuẩn gây bệnh cho người (Syed và cs., 2017)
Nghiên cứu đầu tiên về Solanum mauritianum ở Nam Phi của Uche và cộng sự
(2019), cho thấy các chất chiết xuất thô của 3 chủng vi khuẩn nội sinh thuộc chi Pantoea phân lập từ thân cây có hoạt động kháng lại các vi khuẩn gây bệnh phổ biến ở người (Uche và cs., 2019)
Nghiên cứu mới nhất của Christian và cộng sự (năm 2022), có tổng cộng 41
chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ Solanum torvum Sw, chiết xuất của vi khuẩn nội
sinh cho thấy hoạt tính kháng khuẩn và gây độc tế bào (Christian và cs., 2022) Ngoài ra, vi khuẩn nội sinh có tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và y học là đề tài cũng được các nhà nghiên cứu sinh vật học quan
Năm 2017, Song và cộng sự của mình đã phân lập thành công Bacillus
altitudinis (KX230132.1) nội sinh rễ cây Panax ginseng có khả năng tích lũy và kích
thích tăng lượng ginsenoside, một chất chuyển hóa thứ cấp chính trong cây nhân sâm
(Song và cs., 2017) Năm 2021, dòng vi khuẩn nội sinh Bacillus halotolerans Hil4 được Thomloudi và cộng sự phân lập từ cây thuốc Hypericum hircinum có hoạt tính kháng nấm Botrytis cinerea gây bệnh trên cây nho, cà chua bi và rất nhiều đặc điểm thúc đẩy tăng trưởng thực vật trong ống nghiệm, cho thấy B Haltolerans Hil4 là một
tác nhân kiểm soát sinh học và thúc đầy tăng trưởng thực vật mới đầy hứa hẹn trong tương lai (Thomloudi và cs., 2021)
Một nghiên cứu năm 2020, của Shahzad và cộng sự đã công bố một vi khuẩn
nội sinh mới, Bacillus amyloliquefaciens RWL-1 có khả năng làm tăng hàm lượng
các chất chống oxy hóa như phenolic và aglycone isoflavone trong quá trình lên men đậu tương, có thể được sử dụng trong ngành công nghiệp thuốc và thực phẩm Ngoài ra, khả năng kháng nấm, khả năng sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau
và hợp mới của B Amyloliquefaciens RWL-1 cũng đã được tác giả công bố (Shehzad
và cs., 2020)
Tại Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu trên các hoạt tính của những hợp chất từ cây dược liệu tuy nhiên, có rất ít nghiên cứu về đặc tính của vi khuẩn nội sinh được phân lập từ cây dược liệu Năm 2015, Trần Trọng Hiếu đã phân lập được
Trang 2444 chủng vi khuẩn nội sinh cây trinh nữ tại tỉnh Trà Vinh có đặc tính cố định đạm, tổng hợp IAA và hòa tan lân khó tan, kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn cho thấy có
16 chủng kháng Aeromonas hydrophila, 12 chủng kháng với Escherichia coli, 7 chủng kháng Staphylococcus aureus, 8 chủng có tính kháng với cả Aeromonas
hydrophila và Escherichia coli, 4 chủng kháng Aeromonas hydrophila và Staphylococcus aureus, 1 chủng có tính kháng với cả 3 loài vi khuẩn Aeromonas hydrophila, Escherichia coli và Staphylococcus aureus (Trần Trọng Hiến, 2015)
Năm 2018, 45 chủng vi khuẩn nội sinh từ sâm ngọc linh được phân lập bởi Nguyễn Thị Tâm và cộng sự, trong đó có 27 chủng có khả năng sinh tổng hợp β-glucosidase, một enzyme có khả năng phân cắt các gốc glycoside liên kết với aglycone của ginsenoside Rb1 (Nguyễn Thị Tâm và cs., 2018)
Năm 2019, Nguyễn Hồng Ái Vy đã phân lập được 35 dòng vi khuẩn nội sinh
cây trùm ngây (Moringa oleifera) tại tỉnh Đồng Tháp trong, 9 dòng có khả năng kháng
Escherichia coli, 13 dòng có khả năng kháng Aeromonas hydrophila và 9 dòng có
khả năng kháng Staphylococcus aureus (Nguyễn Hồng Ái Vy, 2019)
Trong những năm gần đây, các công bố trên thế giới đã cho thấy tiềm năng mới của vi khuẩn nội sinh, việc nghiên cứu tại nước ta còn nhiều hạn chế khi chưa có nhiều báo cáo về vi khuẩn nội sinh cây dược liệu, đặc biệt là vi khuẩn nội sinh cây cà
gai leo (Solanum procumbens Lour)
Trang 253 TỔNG QUAN VỀ CÁC VI KHUẨN GÂY BỆNH THÔNG THƯỜNG
3.1 Vi khuẩn Escherichia coli
Loài: Escherichia coli
E coli là trực khuẩn Gram âm Kích thước trung bình 2-3 µm x 0,5 µm; trong
những điều kiện không thích hợp (trong môi trường có kháng sinh), vi khuẩn có thể
dài như sợi chỉ Rất ít chủng E coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng di
động
E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu khí
tùy nghi, nhiệt độ từ 5-40oC Trong điều kiện thích hợp E coli phát triển rất nhanh,
thời gian thế hệ chỉ khoảng 20-30 phút
E coli là vi khuẩn thường trú đường tiêu hóa ở người, có thể được tìm thấy ở
đường hô hấp trên hay đường sinh dục E coli đứng đầu trong các vi khuẩn gây bệnh
tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật, căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết
E coli có khả năng gây bệnh khi xâm nhập vào những vị trí trong cơ thể mà bình
thường chúng không hiện diện (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)
Hình 1.7 Vi thể của E coli dưới vật kính 100X
(wikipedia)
Trang 26Loài: Pseudomonas aeruginosa
P aeruginosa là trực khuẩn mủ xanh, thẳng hoặc hơi cong nhưng không xoắn,
hai đầu tròn, dài 1-5 µm, rộng 0,5-1 µm, ít khi có vỏ có một ít lông ở một đầu, di động, không sinh nha bào, bắt màu Gram âm Chúng mọc ở biên độ nhiệt rộng (10-44oC), tối ưu ở 35oC Trong môi trường đặc hiệu, có thể gặp hai loại khuẩn lạc: một loại to, nhẵn, bờ trải dẹt, giữa lồi lên; một loại khác xù xì
Trực khuẩn mủ xanh là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện: khi cơ thể suy giảm miễn dịch, bệnh ác tính hay mãn tính, khi dùng corticoid lâu dài, việc dùng kháng sinh tùy tiện, Gây nhiễm trùng da, mắt như viêm nang lông, viêm da chảy nước ở
các vùng kẽ hoặc viêm tai ngoài, viêm loét giác mạc, Ngoài ra, P aeruginosa là căn
nguyên gây nhiễm trùng vết bỏng, vết thương, xương khớp, dịch não tủy, tiết niệu và hô hấp (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)
Hình 1.8 Vi thể của P aeruginosa dưới vật kính
100X (wikipedia)
Trang 27Loài: Salmonella typhi
S typhi là trực khuẩn Gram âm, có lông xung quanh thân, có khả năng di động,
không sinh nha bào Kích thước khoảng 0,4-0,6 x 2-3 μm S typhi là vi khuẩn hiếu
khí tùy nghi, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường Trong môi trường thích hợp sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước trung bình 2-4 mm
S typhi chỉ gây bệnh cho người, chủ yếu gây bệnh thương hàn Bệnh thương
hàn có thể gây biến chứng chủ yếu là xuất huyết tiêu hóa và thủng ruột Một số biến chứng ít gặp hơn như viêm màng não, viêm tủy xương, viêm khớp, viêm thận (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)
3.4 Staphylococcus aureus
Ngành: Firmicute Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Staphylococcaceae
Chi: Staphylococcus
Loài: Staphylococcus aureus
Hình 1.9 Vi thể của S typhi dưới vật kính
100X (wikipedia)
Hình 1.10 Vi thể của S aureus dưới vật kính 100X
(wikipedia)
Trang 28S aureus là vi khuẩn Gram dương, hình cầu đường kính 0,5-1,5 µm có thể đứng
riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn, hoặc từng chùm không đều giống như chùm nho, đây là loại vi khuẩn không di động và không sinh bào tử, thường cư trú trên da và màng nhầy của người và động vật máu nóng Trên môi trường Bair Parker, khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2-5 mm
Nhiễm độc có thể do hoạt tính của một hoặc một vài sản phẩm của S aureus
(độc tố) mà không cần có sự hiện diện của vi khuẩn Như hội chứng sốc nhiễm độc,
hội chứng phỏng ngoài da, hội chứng ngộ độc thức ăn Nhiễm trùng là do S aureus
xâm nhập vào cơ quan bảo vệ của vật chủ khi bị tổn thương hay giảm chức năng Như nhiễm trùng da và mô mềm, hệ hô hấp, hệ thần kinh trung ương, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng tiểu, nhiễm trùng nội mạch, xương,…(Nguyễn Thanh Bảo, 2008)
3.5 Vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA)
Ngành: Firmicute Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Staphylococcaceae
Chi: Staphylococcus
Loài: Staphylococcus aureus
MRSA là viết tắt của Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Tụ cầu vàng kháng Methicillin) S aureus kháng methicillin nghĩa là kháng được tất cả các β-
lactam và có thể kháng được aminoglycosides và macrolides Hiện nay, các chủng đề kháng methicillin (gọi tắt là MRSA), một kháng sinh được coi là mạnh nhất trong nhóm β-lactam đã phát triển một cách đáng lo ngại, nhất là trong các trường hợp
Hình 1.11 Vi thể của MRSA dưới vật kính 100X
(wikipedia)
Trang 29methicillin trên S aureus có thể được xem như phát hiện một thông số chỉ điểm được vi khuẩn S aureus kháng đa kháng sinh (CLSI, 2004) MRSA là các chủng S aureus
biểu hiện cơ chế kháng qua mecA thông qua cơ chế kháng methicillin khác
4 TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI NẤM GÂY BỆNH
4.1 Trichophyton rubrum
Hình 1 12 Hình vi thể T rubrum quan sát dưới vật kính 40X
(https:// vi.wikipedia.org/wiki/ Trichophyton rubrum)
T rubrum là một loại nấm sợi sừng hóa, là tác nhân gây bệnh da liễu phổ biến
nhất trên toàn thế giới, chủ yếu ở bàn chân, da và giữa các móng tay của con người
T rubrum được biết đến là một trong những loài nấm da liễu nổi bật nhất, một loại
nấm thường gây bệnh ngoài da, xuất hiện với nhiều màu trắng, vàng, nâu và đỏ Nó cũng có thể được tìm thấy trong các kết cấu khác nhau, có dạng sáp, bông hoặc mịn
Nhiễm trùng T rubrum cực kỳ khó chẩn đoán và khó phân biệt với các loại nấm da
khác (Castellani, 1910)
4.2 Microsporum canis
Hình 1.13 Hình vi thể M canis quan sát dưới vật kính 40X
(https:// vi.wikipedia.org/wiki/ Microsporum canis)
Trang 30Sợi nấm sinh trưởng nhanh, bề mặt khuẩn lạc trắng tới vàng sẫm, mặt sau màu vàng sáng hoặc màu vàng cam Bào tử đỉnh lớn dạng hình thoi và bào tử trưởng thành giới hạn trong những chỗ phình riêng Khoảng 6-15 ngăn, kích thước 8-20 µm x 40-
150 µm M canis thường gây ra những tổn thương ở bất kì nơi nào trên cơ thể (từ
gan, bàn chân, mũi) Bề mặt bệnh không có lông được bao trùm bởi những vảy xám, trường hợp bệnh nặng da có thể trở nên đỏ, chảy dịch (Gräser và cs., 2000)
4.3 Trichophyton mentagrophytes
Hình 1.14 Hình vi thể T mentagrophytes quan sát dưới vật kính 40X
(https:// vi.wikipedia.org/wiki/ Trichophyton mentagrophytes)
Có 2 dạng khuẩn lạc: dạng có hạt và dạng có lông tơ Dạng hạt mịn hoặc dạng hạt thô, mặt trên màu kem đến màu da bò sáng Mặt dưới thay đổi từ màu rám da bò đến nâu tối Dạng có lông tơ, khuẩn lạc nuôi cấy lâu ngày có dang kem, mặt dưới biến đổi từ màu trắng sang vàng đến nâu đỏ Bào tử có hình điếu thuốc, thành mỏng,
có 3-7 ngăn và kích thước 4-8 µm x 20-50 µm T mentagrophytes thường gây những
tổn thương ở những vùng môi, mặt và tay, chân Biểu hiện ban đầu là những nốt sần sùi, mụn nước, mụn mủ, sau đó phát triển thàn vảy cứng màu vàng, trường hợp nặng vết thương đỏ, sưng tấy (Halteh và cs., 2016)
Trang 31PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trang 321 VẬT LIỆU
1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 10 năm 2021 đến tháng 09 năm 2022 tại phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh
1.2 Đối tượng nghiên cứu
Mẫu cây cà gai leo (Solanum procumbens Lour) được thu nhận từ các tỉnh Bình
Định, Bình Dương và được giám định tên khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên-Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh
Các chủng vi khuẩn, vi nấm gây bệnh được cung cấp bởi phòng thí nghiệm
Công nghệ Vi sinh-Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh, gồm các chủng: E
coli, S aureus, S typhi, P aeruginosa, Staphylococcus aureus kháng methicillin
(MRSA), M canis, T rubrum
1.3 Thiết bị và dụng cụ, hóa chất và môi trường
⮚ Thiết bị: cân kỹ thuật, nồi hấp, tủ lạnh, tủ mát, tủ cấy, máy ly tâm, tủ ấm, tủ sấy, kính hiển vi, máy vortex, lò vi sóng,
⮚ Dụng cụ: ống nghiệm, đèn cồn, đĩa petri, giá ống nghiệm, pipette, micropipette, bông gòn, bình scotte, erlen, que cấy vòng, đũa khuấy, kéo, kẹp sắt, …
⮚ Hóa chất: ethanol 70o, ethanol 96o, sodium hypochlorite 5 %, thuốc nhuộm tím kết tinh (crystal violet), thuốc nhuộm lugol, thuốc nhộm safranin O ⮚ Môi trường: NA, NB, TSA, MHA, SDA
Trang 3331
SVTH: DƯƠNG NGỌC LINH 2 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
Sơ đồ 2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Cây cà gai leo (Solanum
Định danh tên khoa học
Định danh tên khoa học
Định danh tên khoa học
Định danh tên khoa học
Định danh tên khoa học
Định danh tên khoa học
Định danh tên khoa học
Định danh tên khoa học
Định danh tên khoa học
Định danh tên khoa học
Định danh tên khoa học
Định danh tên khoa học
Định danh tên khoa học
Định danh tên khoa học
Định danh tên khoa học
Định danh tên khoa học Khảo sát một số hoạt tính sinh học từ các
chủng vi khuẩn nội sinh cà gao leo Làm thuần trên môi trường
Trang 343 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.1 Phương pháp phân lập
thực hiện
Nội dung thực hiện
Thời Gian thực hiện (phút)
Lá Thân Rễ
1
Rễ, thân, lá của cây cà gai leo (Solanum procumbens L.) được rửa dưới vòi
nước chảy mạnh trong 5 phút, cắt mẫu thành các đoạn nhỏ 2-4 cm để dễ thao tác
2 Ngâm mẫu trong ethanol 70 % và lắc nhẹ 3 7 10
Trang 35Thực hiện phân lập theo 3 phương pháp sau:
⮚ Phương pháp 1 đặt mẫu trực tiếp trên môi trường TSA: Mẫu sau khi đã
được xử lý xong, tiến hành đặt mẫu trên môi trường TSA Các đĩa petri đã đặt mẫu được ủ ở 37oC Sau 3-5 ngày tiến hành quan sát các khóm khuẩn mọc lên từ vị trí mẫu đặt trên đĩa petri
⮚ Phương pháp 2 trải dịch chiết cà gai leo trên môi trường TSA: Các bước
thực hiện được tham khảo từ quy trình của Nxumalo và cộng sự (2020) Bước 1: Nghiền nát các mẫu đã được khử trùng trong túi vô trùng và trộn với 1 ml dung dịch đệm phosphat vô trùng (PBS, pH 7,0)
Bước 2: Hút 1 ml dịch chiết trải trên môi trường TSA, ủ ở 37oC trong tối đa 5 ngày, quan sát sự sinh trưởng của khóm vi sinh vật và làm thuần (Nxumalo và cs., 2020)
⮚ Phương pháp 3 trải dịch chiết cà gai leo trên môi trường bổ sung dược
liệu: Thay thế môi trường dinh dưỡng thông thường bằng môi trường có bổ
sung dịch xay cây cà gai leo
Bước 1: Chuẩn bị môi trường phân lập, cây cà gai leo sau khi thu nhận sẽ được rửa sạch dưới vòi nước mạnh để loại bỏ đất Sau đó, nghiền mẫu với nước cất bằng máy xay (1:1/v:v), bổ sung 2 % agar và đem hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 20
- Quan sát đại thể: bằng mắt thường, hay dùng kính lúp cầm tay nhận xét
về kích thước, hình thái, màu sắc,… của khuẩn lạc vi khuẩn nội sinh
Trang 36- Quan sát vi thể: quan sát bằng cách nhuộm Gram và quan sát dưới kính
hiển vi vật kính 100 X Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến làm tiêu bản nhuộm vi khuẩn
Các bước làm tiêu bản nhuộm vi khuẩn:
Bước 1: chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước muối sinh lý ở giữa lam kính Hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để cố định tế bào vi khuẩn
Bước 2: đặt lam kính đã phết vi khuẩn và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ U Nhuộm bằng dung dịch crystal violet trong 1-2 phút, rửa nước, thấm khô
Bước 3: nhuộm lại bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô Bước 4: tẩy màu bằng ethanol 96o, khoảng 15-30 giây (cho đến khi vừa thấy giọt cuối trên lam mất màu), rửa nước, thấm khô
Bước 5: nhuộm bằng dung dịch safranin O trong 1 phút, rửa nước, thấm khô Bước 6: nhỏ dầu soi và quan sát bằng vật kính 100 X
Kết quả: vi khuẩn Gram dương bắt màu tím crystal violet, vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng safranin
Trả lời tiêu bản nhuộm Gram: hình dáng vi khuẩn, cách sắp xếp các vi khuẩn, cách bắt màu của vi khuẩn
3.2 Khảo sát một số hoạt tính sinh học từ các chủng vi khuẩn nội sinh cây
cà gai leo (Solanum procumbens L.)
3.2.1 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh của vi khuẩn nội sinh
⮚ Chuẩn bị dịch ly tâm từ vi khuẩn nội sinh cây cà gai leo:
Các chủng vi khuẩn nội sinh được nuôi cấy trong môi trường NB, ủ ở 37oC trong 24 giờ
Ly tâm dịch nuôi vi khuẩn 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu lấy dịch nổi
⮚ Chuẩn bị dịch vi sinh vật gây bệnh:
- Chuẩn bị dịch vi khuẩn gây bệnh: Vi khuẩn gây bệnh Pseudomonas
aeruginosa, Salmonnela typhi, E coli, MRSA, Staphylococcus aureus được
Trang 37nước muối vô trùng và điều chỉnh dịch khuẩn tương ứng với mật độ vi khuẩn là 108 CFU/ml (0,5 McFarland)
- Chuẩn bị dịch vi nấm gây bệnh: Vi nấm gây bệnh Trichophyton rubrum,
Microsporum canis được cấy trên môi trường SDA ủ 37oC trong 7 ngày, pha loãng trong nước muối vô trùng đến mật độ tế bào tương đương 106
CFU/ml
Dịch vi khuẩn và vi nấm đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút
⮚ Tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật gây bệnh bằng
phương pháp khuếch tán giếng thạch:
- Hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh:
Bước 1: Dùng tăm bông vô trùng trải điều dịch vi khuẩn gây bệnh đã chuẩn bị trên mặt thạch MHA
Bước 2: Đục 4 lỗ có đường kính 6 mm trên thạch đã trải dịch khuẩn bằng dụng cụ đục lỗ
Bước 3: Dùng micropipet hút 70 μl dịch nổi vi khuẩn nội sinh đã chuẩn bị vào 3 giếng, giếng còn lại làm đối chứng ủ ở 37oC, đọc kết quả sau 24 giờ
Chứng dương: kháng sinh Ofloxacin
Kết quả kháng vi khuẩn gây bệnh là đường kính của vùng ức chế đo bằng mm (Sharma và cs., 2019)
Trang 383.2.2 Khảo sát khả năng tiêu huyết của vi khuẩn nội sinh
Các chủng vi khuẩn nội sinh được cấy trên môi trường thạch BA bổ sung 10 % máu cừu Ủ nuôi trong 18-24 giờ ở 37°C
Sau khi ủ quan sát khả năng tiêu huyết α (vùng xanh xung quanh khuẩn lạc), tán huyết β (vùng sáng xung quanh khuẩn lạc) hoặc tán huyết γ (không có vùng xung quanh khuẩn lạc)
3.2.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn nội sinh
Theo phương pháp của Nxumalo và cộng sự (2020):
Dùng tăm bông vô trùng vệt một khuẩn lạc chấm lên đĩa môi trường NA đã bổ sung cơ chất theo bảng dưới và ủ ở 37oC, đọc kết quả sau 24 giờ (Nxumalo và cs., 2020)
Bổ sung cơ chất vào môi trường NA để đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào theo bảng tóm tắt sau:
Enzyme amylase
Môi trường thử nghiệm bổ sung 1% tinh bột
Đọc kết quả với thuốc thử lugol’s iodine Vùng sáng màu đo được là khả năng phân giải tinh bột của vi khuẩn nội sinh
Enzyme cellulase
Môi trường thử nghiệm bổ sung 1% CMC (carboxy methyl cellulose)
Dùng lugol’s iodine để làm thuốc thử Vùng sáng màu là vùng phân giải cellulose của vi khuẩn nội sinh
Trang 40PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU