khảo sát một số dạng đột biến điểm gen apob trên một số bệnh phẩm máu ở người việt nam

18 Bảng III.1 Bộ dữ liệu phản ánh tính chất đột biến trên gen ApoB xuất hiện trên một số mẫu bệnh phẩm và mẫu lành trong các nghiên cứu đoàn hệ và ca chứng .... Nội dung và kế hoạch thực

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

KHẢO SÁT MỘT SỐ DẠNG ĐỘT BIẾN ĐIỂM GEN

APOB TRÊN MỘT SỐ BỆNH PHẨM MÁU Ở NGƯỜI

VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

GVHD: ThS Trương Kim Phượng SVTH: Lâm Thị Ngọc

MSSV: 1553010126 KHÓA: 2015 – 2019

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2019

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến Quý Thầy Cô khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giảng dạy và truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt thời gian học tập tại giảng đường đại học

Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Huyền Ái Thuý, ThS Lao Đức Thuận, ban quản lý phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, cũng như các anh chị và các bạn thực tập tại Phòng đã tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ tận tình để em có thể hoàn thành đề tài Khóa luận tốt nghiệp này một cách tốt nhất

Đặc biệt, em xin cảm ơn ThS Trương Kim Phượng, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo em trong suốt thời gian thực hiện đề tài Khóa luận tốt nghiệp này Cô không chỉ truyền đạt những kiến thức chuyên môn mà còn cho em thấy được tinh thần làm việc, thái độ nghiên cứu đầy nghiêm túc và hiệu quả

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Bố Mẹ và anh chị, những người đã luôn kề bên ủng hộ, giúp đỡ con cả về thể chất lẫn tinh thần, luôn cố gắng tạo điều kiện tốt nhất để con có thể hoàn thành tốt đề tài Khóa luận tốt nghiệp của mình mà không gặp bất kỳ trở ngại nào

Chân Thành Cảm Ơn!

Sinh viên

Lâm Thị Ngọc

HeFH Heterozygous Familial Hypercholesterolaemia HoFH Homozygous Familial Hypercholesterolemia IDLs Intermediate Density Lipoproteins

LDL Low Density Lipoprotein

LDLR Low Density Lipoprotein Receptor

MEDPED Make Early Diagnoses Prevent Early Deaths

MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification NCBI National Center for Biotechnology Information NGS Next Generation Sequencing

PCSK9 Proprotein Convertase Subtilisin / Kexin 9 SSCP Single Strand Conformation Polymorphism VLDLs Very Low Density Lipoproteins

WHO World Health Organization

DANH MỤC BẢNG

Bảng I 1 Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH của tổ chức DLCN 6

Bảng I 2 Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH của tổ chức MEDPED 6

Bảng I 3 Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH của tổ chức Simon Broome 7

Bảng II 1 Thành phần phản ứng PCR 17

Bảng II 2 Chu trình luân nhiệt 18

Bảng III.1 Bộ dữ liệu phản ánh tính chất đột biến trên gen ApoB xuất hiện trên một số mẫu bệnh phẩm và mẫu lành trong các nghiên cứu đoàn hệ và ca chứng 20

Bảng III.2 Chỉ số Proportion phản ánh tỷ lệ đột biến trên gen ApoB trên quần thể người bệnh FH, xét ở một số phân hạng 24

Bảng III 3 Kết quả phân tích tính chất đột biến điểm R3527Q trên exon 26 26

Bảng III.4 Kết quả phân tích chỉ số Odds ratio chỉ số nguy cơ xuất hiện đột biến gen ApoB trên bộ mẫu bệnh phẩm so với bộ mẫu lành 28

Bảng III.5 Các bộ mồi khuếch đại vùng trình tự exon 26 gen ApoB 29

Bảng III 6 Thông số vật lí một số bộ mồi khuếch đại exon 26 thuộc gen ApoB 29

Bảng III.7 Kết quả BLAST trình tự mồi APOB_F1 - APOB_R1 với trình tự NG_011793.1 30

Bảng III 8 Kết quả đo quang phổ mẫu DNA bộ gen trong phân tích đột biến gen ApoB 31

Bảng III.9 Kết quả xác định vị trí các biến thể/đột biến gen ApoB xuất hiện trên một số mẫu bệnh phẩm (mẫu máu) 34

DANH MỤC HÌNH

Hình I.1 Cấu trúc của LDL huyết tương và phức hợp của cholesterol và cholesteryl

esters (Brown et al., 1984) 3

Hình I.2 Gen ApoB định vị trên nhiễm sắc thể 2 (Henderson et al., 2016) 8

Hình I.3 Cơ chế hoạt động của protein ApoB (Soutar et al., 2007) 9

Hình II.1 Sơ đồ quy trình trích xuất dữ liệu trong phân tích tổng hợp 13

Hình III.1 Sơ đồ quy trình trích xuất dữ liệu trong phân tích tổng hợp tính chất đột biến điểm trên gen ApoB 19

Hình III.2 Đồ thị “Forest plot” biểu thị tỷ lệ đột biến gen ApoB trên bộ mẫu bệnh FH 25

Hình III.3 Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính bất đồng nhất của bộ dữ liệu đoàn hệ khi phân tích tỷ lệ đột biến gen ApoB trên bộ mẫu bệnh phẩm FH 26

Hình III.4 Đồ thị “Forest plot” về chỉ số Odds ratio phản ánh tỷ suất chênh trên bộ mẫu bệnh phẩm so với mẫu lành 27

Hình III.5 Vị trí bắt cặp của cặp mồi APOB_F1 - APOB_R1 trên trình tự tham chiếu NG_011793.1 30

Hình III.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR 32

Hình III.7 Đột biến c.10482delA (NM_000374.2); tương ứng vị trí g.42688delA (NG_011793.1) trên mẫu (1) và (2) 35

Hình III.8 Đột biến c.10.712delT (NM_000384.2), g.42918delT (NG_011793.1) trên mẫu (1) và (2) 36

Hình III.9 Dạng đột biến tương ứng c.10594C>A (Leu3532Met) (NM_000384.2); tương ứng vị trí g.42800C>A (NG_011793.1) và tương ứng vị trí g.21006274C>A (NC_000001.12) trên mẫu (1) và mẫu (2) 37

Hình III.10 Dạng đột biến tương ứng c.10652C>A (Ala3551Asp) trên trình tự NM_000384.2; tương ứng vị trí g.42858C>A trên trình tự NG_011793.1 và tương ứng vị trí g.21006216C>A trên trình tự NC_000001.12 trên mẫu (1) 38

Hình III.11 Dạng đột biến tương ứng c.10684C>T (Leu3562Phe) trên trình tự NM_000384.2; tương ứng vị trí g.42890C>T trên trình tự NG_011793.1 và tương ứng vị trí g.21006184C>T trên trình tự NC_000001.12 trên mẫu (1) 39

I TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 3

I.1 Tổng quan về bệnh tăng cholesterol máu có tính gia đình 3

I.1.1.Khái niệm về cholesterol và lipoprotein 3

I.1.2.Bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia – FH) 4

I.1.3.Nguyên nhân bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình 4

I.1.4.Tiêu chí chẩn đoán bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình 5I.2 Gen ApoB 7

I.3 Chức năng và con đường chuyển hóa của protein ApoB 8

I.4 Tình hình nghiên cứu tính chất đột biến trên gen ApoB và bệnh tăng cholesterol trong máu có tính gia đình 9

I.5 Một số phương pháp xác định tính chất đột biến điểm trên gen ApoB 10II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 11

II.1 Vật liệu 11

II.2 Phương pháp 11

II.2.1 Khai thác dữ liệu (Data - mining) 11

II.2.2 Phân tích tổng hợp (Meta – analysis) 12

II.2.3 Khảo sát trên máy tính (In silico) 14

II.2.4 Khảo sát thực nghiệm 15

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

III.1 Kết quả thu thập dữ liệu và phân tích tổng hợp gen ApoB 19

III.1.1 Phân tích chỉ số Proportion 22

III.1.2 Xác định chỉ số tỷ suất chênh (Odds ratio) 26

III.2 Kết quả khảo sát In silico trên gen ApoB 28

III.3 Kết quả khảo sát thực nghiệm 31

III.3.1 Kết quả tách chiết DNA 31

III.3.2 Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự exon 26 gen

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization – WHO), thiếu máu cục bộ tim (Coronary Artery Disease – CAD) còn được gọi là bệnh tim mạch vành (Coronary Heart Disease - CHD) là dạng bệnh lý gây tử vong cao trên thế giới Năm 2016, ước tính có 17,9 triệu người chết vì bệnh tim mạch, chiếm 31% tổng số ca tử vong toàn thế giới (WHO, 2016) Nguyên nhân chính dẫn tới bệnh tim mạch (CVD - Coronary Artery Disease) là do sự tăng bất thường nồng độ LDL cholesterol (LDL - C) trong máu, dẫn đến sự tích tụ mảng xơ vữa ở động mạch và

động mạch chủ, tắc nghẽn mạch máu, thiếu máu cục bộ ở tim (Versmissen et al., 2008, Elis et al., 2011, Raal & Santos, 2012)

Familial hypercholesterolaemia (FH) là dạng bệnh lý tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình, thuộc nhóm bệnh lý di truyền trên nhiễm sắc thể thường

gây rối loạn chuyển hóa lipid thường gặp trên thế giới (Taranto et al., 2015)

Nguyên nhân dẫn đến bệnh FH là do các dạng đột biến điểm xuất hiện trên các gen có chức năng mã hóa protein tham gia chuyển hóa cholesterol, lipid trong máu, cụ

thể là gen: Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR), Apolipoprotein B (ApoB) hoặc Proprotein Convertase Subtilisin–Kexin type 9 (PCSK9) (Sjouke et al., 2014)

Bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình với tỷ lệ ước tính trên toàn

thế giới là 1/500 (0,2%) (Austin et al., 2004)

Nhiều công bố khoa học ghi nhận bênh lý tim mạch (bệnh mạch vành) thuộc nhóm bệnh lý rối loạn đa yếu tố, với sự tác động của cả hai yêu tố môi trường và di truyền (Backer et al., 2003) Tuy nhiên, bệnh lý FH (Familial

hypercholesterolaemia) là nguyên nhân chính dẫn đến các bệnh lý về tim (Austin et al., 2004, Goldstein et al., 1995)

Gen ApoB (Apolipoprotein B) là gen mã hóa cho protein ApoB – 100 và ApoB

– 48, giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành phức hợp giữa Low Density

Lipoprotein (LDL) và Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR) (Chen et al.,

1986)

Những dẫn chứng nêu trên cho thấy ý nghĩa khoa học của ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định tính chất đột biến điểm liên quan đến bệnh lý tăng cholesterol có tính chất gia đình Do đó trong phạm vi chuyên đề khóa luận tốt

nghiệp, chúng tôi thực hiện đề tài khoa học: “Khảo sát một số dạng đột biến điểm

gen ApoB trên một số bệnh phẩm máu ở người Việt Nam”

Mục tiêu nghiên cứu:

- Ứng dụng kỹ thuật PCR kết hợp giải trình tự để xác định sự tương quan giữa

một số dạng đột biến điểm: R3527Q, R3527W xảy ra trên gen ApoB và sự tăng cao

cholesterol trong máu ở người Việt Nam Nội dung và kế hoạch thực hiện đề tài:

- Khai thác dữ liệu trên nguồn dữ liệu khoa học trên NCBI, Google về bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (FH, FDB) trên thế giới và ở Việt Nam

và sự xuất hiện một số dạng đột biến điểm: R3527Q, R3527W gen ApoB trên người

bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình trên thế giới - Phân tích tổng hợp (Meta - analysis)

Sử dụng công cụ thống kê phù hợp phân tích sự tương quan giữa một số dạng đột

biến điểm: R3527Q, R3527W gen ApoB trên người bệnh tăng cholesterol máu trên

thế giới hoặc mắc bệnh tim mạch do tăng cholesterol trong máu

- Khảo sát trên máy tính (In silico)

Thu thập trình tự gen ApoB trên nguồn dữ liệu NCBI (GenBank)

Dựa vào một số công cụ tin sinh học (BLAST, Oligoanalyzer - IDT, Annhyb, ) nhằm khảo sát một số đặc tính (tính đặc hiệu, thông số vật lý,…) của bộ mồi phù hợp với phương pháp PCR kết hợp giải trình tự xác định một số dạng đột biến điểm

trên gen ApoB

- Khảo sát thực nghiệm

Khảo sát quy trình PCR kết hợp giải trình tự xác định một số dạng đột biến điểm

gen ApoB trên một số mẫu bệnh phẩm (mẫu máu) của người Việt Nam

I TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

I.1 Tổng quan về bệnh tăng cholesterol máu có tính gia đình I.1.1 Khái niệm về cholesterol và lipoprotein

Cholesterol là lipid không phân cực, là thành phần cơ bản của cấu trúc màng tế bào động vật và tế bào người Cholesterol là tiền thân của các thành phần quan trọng

trong cơ thể người: nhóm nội tiết tố steroid và axit mật (Cox et al., 1990)

Hình I.1Cấu trúc của LDL huyết tương và phức hợp của cholesterol và

cholesteryl esters (Brown et al., 1984)

Lipoprotein là phức hợp lipid và protein, có chức năng vận chuyển chất béo trong hệ mạch máu và hệ thể dịch đến các tế bào trong các quá trình đồng hóa và tiêu thụ

năng lượng (Wasan et al., 1998) Các dạng Lipoprotein gồm có chylomicrons

(lipoprotein lớn nhất về kích thước), lipoprotein mật độ cao (High Density Lipoprotein – HDL), lipoprotein mật độ thấp (Low Density Lipoprotein – LDL), lipoprotein mật độ trung bình (Intermediate Density Lipoprotein – IDL) và

lipoprotein mật độ rất thấp (Very Low Density Lipoprotein – VLDL) (Wasan et al.,

1998) Thể phức hợp Apolipoprotein gồm lipoprotein và protein ApoB (Apoprotein

B) theo tỷ lệ 1:1 (Carmena et al., 2004) Hình I.1 mô tả cấu trúc của LDL huyết

tương và phức hợp của cholesterol và cholesteryl esters Mỗi hạt LDL có khối lượng 3 x l06

dalton và đường kính 22 nm, gồm khoảng 1500 phân tử “cholesteryl

ester” được bao quanh bởi một lớp ưa nước với khoảng 800 phân tử phospholipid, 500 phân tử cholesterol không ester hóa và 1 phân tử Apoprotein B-100 có trọng

lượng 387.000 dalton (Brown et al., 1986)

I.1.2 Bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia – FH)

Bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia - FH) là một dạng bệnh lý rối loạn chuyển hóa lipid, nguyên nhân do khiếm khuyết di truyền xảy ra trên các gen mã hóa protein tham gia chuyển

hóa lipid, cholesterol trong máu (Brown et al., 1986) Bệnh tăng cholesterol máu có

tính chất gia đình gồm có: ADH (Autosomal Dominant Hypercholesterolemia) là dạng bệnh lý tăng cholesterol máu tính trạng trội trên nhiễm sắc thể thường; ARH (Autosomal Recessive Hypercholesterolemia) là dạng bệnh lý tăng cholesterol máu

tính trạng lặn trên nhiễm sắc thể thường (Taranto et al., 2015)

Công bố khoa học Austin và cộng sự (2004), Khachadurian và cộng sự (1964) ghi nhận bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (FH) gồm có thể đồng hợp (Homozygous Familial Hypercholesterolemia - HoFH) và thể dị hợp (Heterozygous Familial Hypercholesterolemia - HeFH) Theo Brown và cộng sự (1984), tỷ lệ mắc bệnh thể dị hợp HeFH khoảng 1/500 với biểu hiện LDL trong huyết tương cao gấp đôi người bình thường và tỷ lệ mắc bệnh thể đồng hợp HoFH là 1/1.000.000 với biểu hiện LDL trong huyết tương cao gấp sau lần người bình thường Ở bệnh nhân HeFH, nồng độ cholesterol toàn phần và LDL-C trong khoảng 8 - 15 mmol/L (310 – 580 mg/dL) và ở bệnh nhân HoFH, nồng độ cholesterol toàn phần và LDL - C

trong khoảng từ 12 - 30 mmol/L (460 – 1160 mg/dL) (Nordestgaard et al., 2013)

I.1.3 Nguyên nhân bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình

Nguyên nhân chính dẫn đến bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình dạng ADH là do tính chất đột biến trên một số gen khoảng 95% đột biến được phát

hiện nằm trong gen Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR), 2 – 11% là đột biến trên gen Apolipoprotein B (ApoB) và 1% trong Proprotein Convertase Subtilisin–Kexin type 9 (PCSK9) (Benn et al., 2016) Chức năng của thụ thể LDL bị khiếm

khuyết dẫn đến tích tụ lượng lớn cholesterol trong huyết tương, gây xơ vữa động

mạch (Brown et al., 1986) Nồng độ LDL - C tăng cao là kết quả của việc giải phóng không hiệu quả các hạt LDL xuất phát từ các khiếm khuyết trong gen ApoB – 100 (Soria et al., 1989) Sự tích tụ LDL - C trong máu cao dẫn đến nguy cơ mắc bệnh động mạch vành tăng gấp 20 lần (Knowles et al., 2015) Bệnh tăng cholesterol máu thể nặng với chỉ số LDL - C >190 mg/dL (Khera et al., 2016)

Ngoài ra còn có nguyên nhân khác dẫn đến bệnh tăng cholestreol máu như các yếu tố môi trường, giới tính, tuổi tác, thói quen sinh hoạt (hút thuốc lá, ít vận động )

(Soutar et al., 2007)

Thể khiếm khuyết Apolipoprotein B – 100 có tính chất gia đình (Familial defective

Apolipoprotein B-100 – FDB) là một dạng bệnh FH, thuộc nhóm ADH (Azian et al., 2006) Nguyên nhân dẫn đến bệnh lý FDB là do các dạng đột biến xuất hiện trên gen ApoB: R3500 (tên gọi khác R3527Q), R3500W, R3531C và R3480P…Những

dạng đột biến sai nghĩa dẫn đến sự sai hỏng (khiếm khuyết) trên cấu trúc của protein ApoB - 100, từ đó thay đổi cấu trúc của protein ApoB - 100 cản trở sự tương tác giữa ApoB và với thụ thể LDLR làm giảm sự hấp thu LDL vào trong tế

bào, do đó nồng độ cholesterol trong máu tăng cao bất thường (Ejarque et al., 2008; Azian et al., 2006) Theo công bố của Tybjærg-Hansen và cộng sự (1992), tỷ lệ mắc

bệnh FDB 1/500 đến 1/700 ở châu Âu và châu Mỹ

I.1.4 Tiêu chí chẩn đoán bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình

Trên thế giới, bệnh nhân tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình được chẩn đoán dựa vào các tiêu chí đánh giá của: tiêu chuẩn Hà Lan (Dutch Lipid Clinic Network - DLCN), Simon Broome của Vương quốc Anh và tiêu chuẩn của Hoa Kỳ (Make Early Diagnoses Prevent Early Deaths Program Diagnostic Criteria -

MEDPED) (Benn et al., 2016)

Bảng I.1Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH của tổ chức DLCN (Shapiro et al., 2018)

6,5 – 8,4 mmol/L (251 – 325 mg/dL) 5,0 – 6,4 mmol/L (191 – 259 mg/dL) 4,0 – 4,9 mmol/L (155 – 190 mg/dL)

8 5 3 1 Phân tích DNA: Xuất hiện các đột biến gây bệnh FH

trên các gen LDLR, ApoB hay PCSK9

8

Rất có khả năng mắc bệnh FH Có khả năng mắc bệnh FH Không mắc bệnh FH

> 8 6 – 8 3 – 5 < 3

Bảng I.2Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH của tổ chức MEDPED

(Williams et al., 1993)

Tuổi (năm)

Nồng độ Cholesterol toàn phần (mg / dL) Thế hệ thứ nhất

mắc bệnh FH

Thế hệ thứ hai mắc bệnh FH

Thế hệ thứ ba mắc bệnh FH

Bảng I.3Tiêu chí chẩn đoán bệnh FH của tổ chức Simon Broome

(Pécin et al., 2017)

Chẩn đoán khẳng định mắc bệnh FH

Đối với người trưởng thành: cholesterol >7,5 mmol/dL hoặc LDL-C > 4,9 mmol/dL

Đối với trẻ em: cholesterol >6,7 mmol/dL hoặc LDL-C >4,0 mmol/dL Xuất hiện xanthomas gân ở người bệnh hay thế hệ thứ nhất hoặc thứ hai trong gia đình người bệnh

Chẩn đoán rất có thể mắc

Trong tiền sử gia đình có người có nồng độ cholesterol toàn phần >7,5 mmol/dL ở thế hệ thứ nhất hay thứ hai

I.2 Gen ApoB

Gen ApoB (Apolipoprotein B) có kích thước khoảng 43 kb, gồm 28 intron và 29

exon, và nằm gần đầu cánh tay ngắn của nhiễm sắc thể số 2 (NC_000002.12-NCBI)

vị trí 2p24.1) (Innerarity et al., 1990)

Gen ApoB (Apolipoprotein B) mã hóa protein ApoB–100 (4536 amino acid) và ApoB–48 (2152 amino acid) (Knott et al., 1986; Innerarity et al., 1987) Protein ApoB–100 được tổng hợp ở gan và ApoB–48 hiện diện ở ruột (Chen et al., 1986)

Apolipoprotein B–100 là thành phần apolipoprotein tạo nên cấu trúc lipoprotein mật độ cao (High Density Lipoprotein – HDL), lipoprotein mật độ thấp (Low Density Lipoprotein – LDL), lipoprotein mật độ trung bình (Intermediate Density Lipoprotein – IDL) và lipoprotein mật độ rất thấp (Very Low Density Lipoprotein –

VLDL) (Bell – Quint&Graham, 1981; Kane, 1983; Feingold et al., 2018) Lipoprotein mật độ thấp (LDL) là chất mang cholesterol chính trong máu (Chung et al., 2004)

Hình I.2 Gen ApoB định vị trên nhiễm sắc thể 2 (Henderson et al., 2016)

I.3 Chức năng và con đường chuyển hóa của protein ApoB

Protein ApoB là phối tử (Ligand) giúp thụ thể LDL (LDLR) liên kết đặc hiệu với các LDL-C (LDL - Cholesterol) hình thành phức hợp LDLR – LDL-C và xâm nhập vào bên trong tế bào thông qua các endosome Bên trong endosome, LDL sẽ được giải phóng khỏi LDLR và bị thủy phân trong lysosome thành các cholesterol tự do Đồng thời, LDLR sẽ được vận chuyển trở về màng tế bào để thực hiện chức năng

(Brown et al., 1986)

Tính chất đột biến xuất hiện trên gen ApoB dẫn đến thay đổi cấu trúc của protein

ApoB ngăn cản protein này gắn với thụ thể LDLR, từ đó làm giảm sự hấp thu C vào trong tế bào, hệ quả là nồng độ cholesterol trong máu tăng cao bất thường

LDL-(Innerarity et al.,1990)

Hình I.3 Cơ chế hoạt động của protein ApoB (Soutar et al., 2007)

I.4 Tình hình nghiên cứu tính chất đột biến trên gen ApoB và bệnh tăng

cholesterol trong máu có tính gia đình

Bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình phổ biến nhiều ở một số cộng

đồng người Canada, Hà Lan, Phần Lan, Israel (Austin et al., 2004) Theo công bố

khoa học của Akioyamen và cộng sự (2017) xác định tỷ lệ mắc bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình là 1/250 người trường thành trong dân số thế giới Tỷ lệ xuất hiện bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình ở cả nam và nữ là như nhau nhưng tỷ lệ mắc bệnh khác nhau khi xét theo địa lý (vùng miền: nơi người bệnh sinh sống) và độ tuổi

Công bố khoa học của Soutar và cộng sự (2004) cho thấy hơn 1/3 trẻ em ở Na Uy mắc bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình Các bệnh nhân nhi có nguy cơ mắc bệnh CHD cao khi có lượng cholesterol toàn phần trong máu lớn hơn 8 mmol/L (309 mg/dL)

Trong một nghiên cứu ở Đan Mạch, tỷ lệ đột biến trên gen ApoB xảy ra trên biến

thể Arg3500Gln là 1/1000, đây là nguyên nhân gây tăng cholesterol trong máu

nghiêm trọng và tăng nguy cơ mắc bệnh tim mạch vành (Tybjærg-Hansen et al.,

1998) Công trình nghiên cứu của Kalina và cộng sự (2001) sử dụng phương pháp

AS - PCR xác định tỷ lệ đột biến R3500Q trên exon 26 gen ApoB là 0,01% trong

tổng số bệnh nhân 21.000 bệnh nhân FH ở Hungary Đây là dạng đột biến đã được cập nhật tên trên hệ thống LOVD (https://databases.lovd.nl/shared/genes/APOB): R3527Q

Ở Việt Nam, công bố khoa học của Truong và cộng sự (2017) đã xác định tỷ lệ đột

biến trên gen ApoB do đột biến xảy ra xung quanh codon 3500 là 67,5% trong tổng

số 40 bệnh nhân tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình bằng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự

I.5 Một số phương pháp xác định tính chất đột biến điểm trên gen ApoB

- Phương pháp PCR kết hợp giải trình tự (PCR – Sequencing) xác định trình tự nucleotide trên gen mục tiêu hoặc bộ gen nhằm phát hiện các đột biến điểm và chỉ ra bản chất của đột biến này là nguyên nhân dẫn đến một số bệnh di truyền, tiêu

biểu là bệnh FH (Jensen et al., 1996)

- Phương pháp Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) kỹ thuật này cho phép phân tích tính đa hình của cấu hình sợi đơn nucleic, là một trong những kỹ thuật thông dụng nhằm phát hiện sự tồn tại của các đột biến điểm chưa biết trên một trình tự khi so sánh với một trình tự chuẩn không mang đột biến

(Hayashi et al., 1991)

- Phương pháp Allele Specific PCR (AS - PCR) này có độ nhạy cao dùng để phát hiện các dạng đột biến đã biết bằng cách thực hiện phản ứng PCR khuếch đại allele hoang dại và allele đột biến Sau đó sản phẩm PCR sẽ được điện di trên gel

agarose hay gel polyacrylamide để đọc kết quả (Mahdieh et al., 2013)

- Phương pháp điện di trên gel biến tính (Denaturing Gradient Gel Eletrophoresis – DGGE) là một kỹ thuật nhanh và nhạy để phát hiện đột biến dựa trên sự khác nhau về thành phần nucleotide Kỹ thuật này dựa trên sự di chuyển của

các phân tử DNA sợi đôi thông qua gel polyacrylamide (Fodde et al., 1994)

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

- BioEdit phiên bản v7.0.4

II.2 Phương pháp

II.2.1 Khai thác dữ liệu (Data - mining)

Khai thác dữ liệu khoa học trên nguồn dữ liệu PubMed, PubMed central (PMC) thuộc NCBI và các nguồn dữ liệu trực tuyến khác (EMBL, Google …)

Sử dụng một số từ khóa: ApoB, Familial Hypercholesterolemia (FH), Familial

defective apolipoprotein B100 (FDB), Autosomal Dominant Hypercholesterolemia (ADH), PCR, giải trình tự …

Trích xuất dữ liệu: `

- Tình hình mắc bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (FH, FDB) tim mạch do mắc bệnh lý tăng cholesterol máu có tính chất gia đình (FH, FDB) trên thế giới và ở Việt Nam

- Thông tin về phương pháp sinh học phân tử (PCR kết hợp phương pháp giải

trình tự, PCR ) phù hợp để xác định đột biến điểm trên gen ApoB trên từng

quần thể người bệnh tăng cholestreol máu có tính chất gia đình trên thế giới và ở Việt Nam

- Tổng hợp, chọn lọc thông tin và tỷ lệ của từng dạng đột biến đểm nổi trội

thuộc gen ApoB xuất hiện trên nhóm người mắc bệnh FH / người mắc bệnh

tim mạch bằng công cụ thống kê phù hợp

II.2.2 Phân tích tổng hợp (Meta – analysis)

Phân tích tổng hợp là phương pháp phân tích thống kê của nhiều nghiên cứu độc lập đã được công bố và thường sử dụng thử nghiệm phân bố ngẫu nhiên (Randomised Controlled Trials – RCTs) (Glass, 1976) Dựa vào công bố khoa học của Hunter và Schmidt (1990), phân tích tổng hợp tập trung vào một số tiêu chí: Lực nghiên cứu (Power); chỉ số cỡ mẫu; biến số: biến nhị phân và độ lệch chuẩn (biến liên tục) Các bước để thực hiện phân tích tổng hợp (Basu, 2017):

Bước 1: Xây dựng quy chuẩn để thu thập thông tin dựa trên mẫu trả lời câu hỏi “PICO - Participant-Intervention-Comparator-Outcomes”, Participant được hiểu theo nghĩa đối tượng nghiên cứu, Intervention là sự tác động đến đối tượng nghiên cứu, tiếp theo Comparator nghĩa là so sánh các đối tượng dưới những tác động khác nhau và cuối cùng là Outcomes – đưa ra kết quả

Bước 2: Thu thập nguồn thông tin qua các ngân hàng dữ lệu như NCBI, Google Scholar…và kết hợp toán tử tìm kiếm: “AND”, “OR”, và “NOT” để giới hạn phạm vi tìm kiếm

Bước 3: Đọc tiêu đề, nội dung tóm tắt và nội dung toàn văn của các công bố nghiên cứu để xác định trọng tâm của nghiên cứu, sử dụng sơ đồ quy trình PRISMA (Preferred Reporting Items of Systematic Reviews and Meta - analyses) để sàng lọc và chọn bài nghiên cứu phù hợp

Hình II.1 Sơ đồ quy trình trích xuất dữ liệu trong phân tích tổng hợp

Bước 4: Sau khi chọn được bài nghiên cứu phù hợp, tiến hành đọc và hiểu phần thực nghiệm và tiến hành trích xuất dữ liệu dự kiến bao gồm các phân hạng/ thông tin:

- Tác giả, năm xuất bản

- Thông tin về bệnh nhân: quốc gia, dân tộc, loại mẫu (mẫu máu)

- Dạng công trình nghiên cứu: ca chứng (case - control study), đoàn hệ (cohort study) hoặc tại một thời điểm (cross - sectional)

- Phương pháp xác định tính chất đột biến trên gen mục tiêu

- Tỷ lệ đột biến trên gen mục tiêu cũng như các nguy cơ trên mẫu bệnh (Case samples) và mẫu chứng (Control samples)

Bước 5: Đánh giá sự khác biệt giữa các bài nghiên cứu Hunter và Schmidt (2000) đưa ra khái niệm về mô hình có mẫu ngẫu nhiên (Random effects meta-analysis) và mô hình có mẫu cố định (Fixed - effects Meta - analysis) cho một tiêu

chí nhị phân (a dichotomous outcome) với khoảng tin cậy 95% (CI) nhằm đánh giá

tính tương quan giữa yếu tố nguy cơ (tính chất đột biến trên gen ApoB) và nguy cơ

mắc bệnh tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình

Bước 6: Xuất biểu đồ tương ứng với loại mô hình mẫu nghiên cứu thông qua phần mềm thống kê tổng hợp Medcalc (phiên bản v18) được ứng dụng để phân tích tỷ lệ đột biến (Proportion), chỉ số tỷ suất chênh (Odds ratio - OR), chỉ số nguy cơ (Hazard ratio - HR) với khoảng tin cậy 95% (Confidence intervals - CIs)

Dựa vào thuật toán Chi bình phương, xác định chỉ số bất đồng nhất (Index of Heterogeneity: I2) theo thang giá trị: 0 - 100% (Higgins et al., 2003; Ryan, 2014)

và hệ thống Cochrane:

- Tính bất đồng nhất thấp: 0%<I2< 40% - Tính bất đồng nhất vừa: 30%<I2 < 60% - Tính bất đồng nhất cao: 50%<I2 < 90% - Tính bất đồng nhất rất cao: I2>75%

II.2.3 Khảo sát trên máy tính (In silico)

Tiến hành khảo sát trên máy tính (In silico) nhằm xác định bộ mồi phù hợp với

phương pháp PCR kết hợp giải trình tự nhằm xác định các đột biến nổi trội trên

các exon thuộc gen ApoB:

- Thu thập dữ liệu trình tự nucleotide của gen ApoB trên cơ sở dữ liệu

GenBank (NCBI)

- Thu thập bộ mồi phù hợp với phương pháp PCR kết hợp giải trình tự nhằm

xác định các đột biến nổi trội trên các exon 26 thuộc gen ApoB được mô tả

trong một số công bố khoa học trên thế giới và ở Việt Nam

- Xác định các thông số vật lí của bộ mồi bằng công cụ OligoAnalyzer 3.1 (IDT) và Annhyb phiên bản 4.946, phân tích chiều dài mồi, nhiệt độ nóng chảy, %GC, cấu trúc kẹp tóc, Self – dimer, Hetero – dimer

- Kiểm tra độ đặc hiệu của bộ mồi bằng công cụ BLAST trên NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

Một số tiêu chí thiết kế mồi cho phương pháp PCR trong tài liệu Giáo trình Ứng dụng tin học trong Công nghệ sinh học (Lê Huyền Ái Thúy, 2016) và hướng dẫn của IDT (http://sg,idtdna,com/calc/Analyzer):

- Chiều dài mồi: 17 – 28 nucleotide, tối thiểu 15 nucleotide - Sản phẩm PCR: 100 - 600 bp

- Máy đo quang phổ - Máy PCR

(2) Hóa chất: - Phenol - Chloroform

- Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10% - NaCl 0,45M

- Tris HCl 10mM (pH = 8,2)

- Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1M (pH = 8) - Ammonium acetate (NH4OAc) 5M

- Ethanol 100% - Ethanol 70%

- Proteinase K (18,5 mg/ml) - Master mix 2X

- Bộ mồi

Xác định sự tương quan giữa tính chất đột biến điểm nổi trội trên exon 26 của gen

ApoB và khả năng mắc bệnh / không mắc bệnh tăng cholesterol trong máu có tính

gia đình, người Việt Nam, gồm một số nội dung thực nghiệm:

(1) Tách chiết DNA bộ gen của bộ mẫu bệnh phẩm (mẫu máu) bằng phương pháp Phenol / Chloroform (Chomczynski & Sacchi, 1987)

- Thu nhận 50 μl mẫu bệnh phẩm vào một eppendorf (1,5 ml)

- Bổ sung 500 µl dung dịch ly giải, gồm có NaCl 0,45M, Tris HCl 10mM (pH=8,2), EDTA 1M (pH=8), SDS 10%

- Bổ sung 5 μl proteinase K (20 mg/ml), trộn đều Ủ ở nhiệt độ 56oC trong 1 giờ

- Bổ sung một thể tích dung dịch phenol: chloroform (tỷ lệ 1:1), trộn đều Ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13.000 vòng / phút trong 3 phút và thu dịch nổi

- Bổ sung một thể tích Chloroform tương đương với thể tích mẫu Ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13.000 vòng / phút trong 3 phút và thu dịch nổi

- Bổ sung 0,25 lần thể tích Amonium Acetate 5M và 2,5 lần thể tích Ethanol tuyệt đối (trữ lạnh) Ly tâm 13000 vòng / phút trong 20 phút ở 4oC và thu tủa

- Bổ sung một thể tích Ethanol 70%, ly tâm 13.000 vòng / phút trong 5 phút ở 4oC

- Thu cặn, xử lý để làm khô mẫu DNA bộ gen và bảo quản trong 20 - 50 μl dung dịch Tris - EDTA (pH8), ở -20oC

(2) Xác định chất lượng DNA bộ gen bằng phương pháp đo quang phổ: Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 260nm

- Độ tinh sạch của DNA được đánh giá qua tỷ lệ A260/A280 DNA thu nhận đã tinh sạch khi giá trị này dao động từ 1,8 – 2

- Công thức xác định nồng độ DNA: C (µg / ml) = 50 x A260 x d

Chú thích: C: giá trị nồng độ DNA (μg / ml)

A260: độ hấp thụ của dung dịch DNA ở bước sóng 260 nm A280: độ hấp thụ cực đại của protein ở bước sóng 280 nm d: độ pha loãng (thường từ 30 - 50 lần)

(3) Phương pháp PCR

Chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự exon 26 gen

ApoB bằng cặp mồi phù hợp được lựa chọn trong nội dung khảo sát trên máy tính (In silico) Thành phần phản ứng PCR và chương trình nhiệt được trình bày ở Bảng

Bảng II.2Chu trình luân nhiệt

Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kì

- Rót gel vào khuôn, chờ gel đông, rút lược

- Chuẩn bị mẫu DNA (sản phẩm PCR) hòa trộn với dung dịch nạp mẫu có bổ sung Gel Red theo tỷ lệ phù hợp

- Nạp mẫu vào giếng

- Tiến hành điện di bản gel agarose 1,5% ở hiệu điện thế 70 volt trong 30 phút - Đọc kết quả bằng máy đọc gel (Gel Doc XR, BioRad) với tác động của tia

UV đến chất nhuộm (Gel Red) để biểu thị sự hiện diện của các băng sản phẩm PCR và so sánh kích thước với thang chuẩn 50 bp

(5) Giải trình tự

Các sản phẩm PCR cho kích thước như dự kiến trong khoảng 300 - 400 bp sẽ được tiến hành gửi giải trình tự Dựa trên kết quả phân tích giải trình tự nhằm khảo sát sự

tương quan giữa tính chất đột biến điểm nổi trội của gen ApoB và bệnh tăng

cholesterol máu có tính gia đình trên người bệnh Việt Nam bằng công cụ Chromas Lite phiên bản 2.6.6 và CodonCode Aligner phiên bản 8.0.2 và trình tự tham chiếu NG_011793, NM_000384.2

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

III.1 Kết quả thu thập dữ liệu và phân tích tổng hợp gen ApoB

Khai thác dữ liệu cập nhật đến tháng 1 năm 2019 Chúng tôi thu thập được 109 công bố khoa học liên quan đến bệnh FH Dựa theo tiêu chí trích xuất dữ liệu, chọn

lọc ra 24 công bố khoa học về gen ApoB (Hình III.1 và Bảng III.1) để thực hiện

phân tích tổng hợp nhằm xác định chỉ số (Proportion - PR%) phản ánh sự tương

quan giữa tính chất đột biến trên gen ApoB với bệnh tăng cholesterol máu có tính

chất gia đình và một số bệnh liên quan trên thế giới và ở Việt Nam

Hình III.1Sơ đồ quy trình trích xuất dữ liệu trong phân tích tổng hợp tính

chất đột biến điểm trên gen ApoB

Các nghiên cứu được xác định từ cơ sở dữ liệu

Nghiên cứu hoàn chỉnh thích hợp

Bảng III.1Bộ dữ liệu phản ánh tính chất đột biến trên gen ApoB xuất hiện trên một số mẫu bệnh phẩm và mẫu lành

trong các nghiên cứu đoàn hệ và ca chứng

e

Chú thích: P: “Proband” và “single case” là các mẫu bệnh phẩm được thu nhận từ các bệnh nhân riêng biệt; F: “Family” là các mẫu bệnh phẩm được thu nhận từ các bệnh nhân có cùng họ hàng (huyết thống/phả hệ)

Sau khi sàng lọc và trích xuất dữ liệu, chúng tôi thu nhận được bộ dữ liệu gồm 24 công bố khoa học gồm đoàn hệ và ca chứng với tổng số 14.035 mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân tăng cholesterol trong máu có tính chất gia đình (FH, FDB) Bên cạnh đó, bộ dữ liệu cung cấp các dạng mẫu bệnh phẩm được thu nhận ở dạng “Proband” là các ca bệnh hoặc người khỏe mạnh riêng lẻ và dạng “Family” là các ca bệnh hoặc người khỏe mạnh có quan hệ huyết thống

Chúng tôi ghi nhận bộ dữ liệu này có tính bất đồng nhất rất cao (I2 = 99,07%, P < 0,0001) Do đó, chúng tôi chọn mô hình phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects model, R) xác định chỉ số Proportion tổng số, kết quả thể hiện ở Hình III.2 và Hình III.3 và Phụ lục 1

III.1.1 Phân tích chỉ số Proportion (%PR)

Đầu tiên, nội dung phân tích tổng hợp xác định chỉ số “Proportion” tổng số Dữ

kiện này nhằm phản ánh tỷ lệ xuất hiện các dạng đột biến trên gen ApoB đối với bộ

mẫu bệnh phẩm của các ca mắc bệnh FH trên thế giới là PR = 23,968% (95% CI: 16,281 - 32,616; mô hình R) Kết quả này có giảm so với kết quả công bố của cùng nhóm nghiên cứu: Truong và cộng sự (2018) Trong công bố của Truong và cộng sự

(2018), chỉ số Proportion phản ánh tỷ lệ xuất hiện các dạng đột biến trên gen ApoB

là 37,77% trên 17.303 trường hợp cao cholesterol trong máu có tính gia đình trên thế giới Tuy nhiên, các kết quả phân tích cho thấy tỷ lệ xuất hiện các dạng đột biến

trên gen ApoB đối với bộ mẫu bệnh phẩm của các ca mắc bệnh FH trên thế giới

luôn cao hơn 20%, trong khoảng 23 - 38% Đây là dữ liệu thể hiện sự tương quan

giữa tính chất đột biến trên gen ApoB và với bệnh lý FH và FDB

Thêm vào đó, chúng tôi tiếp tục phân tích chỉ số Proportion trên các phân hạng: phương pháp phân tích đột biến điểm, châu lục của các nhóm bệnh nhân, nhóm “Proband” hoặc “Family”

Hơn nữa, bộ dữ liệu phản ánh dạng đột biến nổi trội xuất hiện trên exon 26 gen

ApoB liên quan đến bệnh FH, FDB đối với nhóm bệnh nhân riêng lẻ (Proband) là

25,770% (95%CI: 17,711 - 19,003; mô hình R) và nhóm bệnh nhân có họ hàng, quan hệ huyết thống là 10,045% (95%CI: 4,265 - 17,910; mô hình R) Dữ liệu này

cho thấy tính chất đột biến trên gen ApoB xảy ra ở các cá thể độc lập và có tính di

truyền Do vậy, việc thiết lập công cụ sinh học phân tử phù hợp để mô tả rõ nét đặc

điểm phân tử của gen ApoB cũng như các gen khác mã hóa protein tham gia chuyển

hóa cholesterol trong máu để có thể hỗ trợ, tư vấn, khuyến cáo cho các trường hợp mang các dạng đột biến - nguyên nhân chính dẫn đến rối loạn cholesterol trong máu

- Xét về phương pháp phân tích tính chất đột biến

Xét yếu tố phương pháp, chỉ số “Proportion” phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến trên

gen ApoB thuộc bệnh nhân tăng cholesterol máu có tính chất gia đình ở những công

trình nghiên cứu đoàn hệ sử dụng phương pháp PCR - giải trình tự và các phương pháp sinh học phân tử khác lần lượt 34,868% (95% CI: 16,552 - 55,881; mô hình R) và 19,469% (95% CI: 11,847 - 28,448; mô hình R) Kết quả nghiên cứu ghi nhận

phương pháp PCR - giải trình tự phát hiện tỷ lệ đột biến trên gen ApoB trên bộ mẫu

bệnh phẩm từ các bệnh nhân có chỉ số cholesterol trong máu tăng bất thường là xấp xỉ 34,868% (Bảng III.2), cao hơn so với nhóm các phương pháp khác (Real - time PCR, MLPA, AS - PCR, PCR - RELP, NGS…)

- Xét về yếu tố chủng tộc của bệnh nhân FH

Chỉ số “Proportion” phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến trên gen ApoB thuộc bệnh

nhân tăng cholesterol máu có tính gia đình ở châu Á, châu Âu, và châu Mỹ lần lượt là 36,216% (95%CI: 24,185 – 49,197; mô hình R); 19,762% (95%CI: 9,424 – 32,751; mô hình R) và 17,750% (95%CI 3,464 – 39,790; mô hình R) Qua đó, dữ

liệu phân tích biểu thị tỷ lệ đột biến gen ApoB trên nhóm bệnh nhân FH, FDB ở

châu Á cao hơn ở châu Âu và châu Mỹ Kết quả phân tích phản ánh nhóm người châu Á có nguy cơ mắc bệnh tăng cholesterol máu có tính chất gia đình cao hơn so với nhóm người châu Âu và châu Mỹ (Bảng III.2)

Đây là dữ kiện cho thấy tầm quan trọng và ý nghĩa thực tiễn của hướng nghiên cứu về đặc điểm phân tử bệnh FH, FDB ở quần thể người châu Á cũng như ở Việt Nam để từ đó tạo tiền đề thiết lập công cụ sàng lọc, dự đoán bệnh lý FH, FDB và hỗ trợ phát triển các liệu pháp điều trị phù hợp nhằm làm giảm nguy cơ mắc các bệnh lý

liên quan (động mạch vành, đột quỵ,…) đối với các ca mắc bệnh rối loạn chuyển hóa cholesterol có tính gia đình: FH, FDB

- Xét về yếu tố đột biến nổi trội trên gen ApoB

Kết quả phân tích tổng hợp ghi nhận có 23/24 công bố khoa học ghi nhận các dạng

đột biến R3527Q trên exon 26 thuộc gen ApoB xuất hiện trên DNA bộ gen của các

bệnh nhân FH Kết quả xác định chỉ số “Proportion” phản ánh tỷ lệ đột biến xuất

hiện trên exon 26 thuộc gen ApoB là 20,342% (95% CI: 13,816 – 27,764, mô hình

R) là cao nhất so với chỉ số “Proportion” phản ánh tỷ lệ đột biến xuất hiện trên các

exon khác thuộc gen ApoB (Bảng III.2 và Phụ lục 2) Từ đó, nội dung phân tích

tổng hợp được tiến hành chi tiết hơn nhằm xác định rõ dạng đột biến nổi trội xuất

hiện trên exon 26 thuộc gen ApoB

Kết quả phân tích chỉ số “Proportion” phản ánh tỷ lệ xuất hiện đột biến R3527Q và

nhóm các dạng đột biến khác trên exon 26 thuộc gen ApoB lần lượt là 11,488%

(95%CI: 7,672 - 15,956; mô hình R), 31,259% (95% CI: 20,65 – 42,939; mô hình R) Các kết quả này mô tả ở Bảng III.3 và Phụ lục 3

Bảng III.2Chỉ số Proportion phản ánh tỷ lệ đột biến trên gen ApoB trên quần

thể người bệnh FH, xét ở một số phân hạng Phân tích tính bất đồng nhất

Phương pháp

PCR-Giải trình tự 8 34,868 [16,552 - 55,881] < 0,0001 97,36 2,653,980 R Khác 16 19,469 [11,847 - 28,448] < 0,0001 99,16 17,952,089 R

Quần thể

Châu Á 7 36,216 [24,185 - 49,197] < 0,0001 97,30 2,218,180 R Châu Âu 14 19,762 [9,424 - 32,751] < 0,0001 98,89 11,703,510 R Châu Mỹ 3 17,750 [3,464 - 39,790] <0,0001 99,37 3,181,047 R

Exon

Exon 26 23 20,342 [13,816 - 27,764] <0,0001 99,07 2464,225 R

Hình III.2Đồ thị “Forest plot” biểu thị tỷ lệ đột biến gen ApoB trên bộ mẫu bệnh FH.

Hình III.3Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính bất đồng nhất của bộ dữ liệu

đoàn hệ khi phân tích tỷ lệ đột biến gen ApoB trên bộ mẫu bệnh phẩm FH

Bảng III.3Kết quả phân tích tính chất đột biến điểm R3527Qtrên exon 26

III.1.2 Xác định chỉ số tỷ suất chênh (Odds ratio)

Trong bộ dữ liệu 5 công bố khoa học ca chứng tổng số đột biến trên bộ mẫu bệnh phẩm là 2.321 mẫu (mẫu máu), tổng số mẫu lành là 2.365 mẫu (mẫu máu) Dựa vào chỉ số bất đồng nhất I2 = 65,25%, chúng tôi áp dụng mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên để xác định tỷ suất chệnh (OR) về khả năng xuất hiện tính chất đột biến trên gen

ApoB trên nhóm mẫu bệnh phẩm liên quan đến các bệnh lý chuyển hóa và nhóm

mẫu lành (Hình III.4) Kết quả tổng thể phản ánh chỉ số tỷ suất chênh của sự xuất

hiện đột biến trên gen ApoB trên bộ mẫu bệnh phẩm so với bộ mẫu lành là 1,235%

dao động trong khoảng 95%CI (0,953 – 1,602), p value= 0,111 Điều này cho thấy

chưa có sự khác biệt về khả năng xuất hiện đột biến ApoB trên mẫu bệnh phẩm và