phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi ageratum conyzoides và khảo sát khả năng đối kháng với một số vi sinh vật gây bệnh

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

PHÂN LẬP VI SINH VẬT NỘI SINH TỪ CÂY CỎ HÔI

KHÁNG VỚI MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNHKHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: Th.S Dương Nhật Linh SVTH: Phạm Thị Ngọc Phượng MSSV: 1253012295

Khóa: 2012 - 2016

Tp Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2016

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

PHÂN LẬP VI SINH VẬT NỘI SINH TỪ CÂY CỎ HÔI

KHÁNG VỚI MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNHKHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: Th.S Dương Nhật Linh SVTH: Phạm Thị Ngọc Phượng MSSV: 1253012295

Khóa: 2012 - 2016 GVHD ký xác nhận:

Tp Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2016

Cô Dương Nhật Linh, thầy Nguyễn Văn Minh đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt

cho em những kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em hoàn thành đề tài trong suốt thời gian thực hiện

Chị Nguyễn Thị Mỹ Linh và chị Trần Thị Á Ni đã cho những ý kiến đóng góp

quan trọng trong quá trình tìm hiểu vấn đề, cảm ơn các bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh luôn ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Các bạn khóa 12 đã quan tâm và chia sẻ cùng tôi quãng đời sinh viên nhiều kỉ niệm đẹp và đáng nhớ

Cuối cùng, con xin cảm ơn Ba Mẹ, cảm ơn gia đình, người thân và các anh chị

luôn chăm lo, ủng hộ, tin tưởng, khích lệ con những lúc khó khăn và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để con được yên tâm học hành, nghiên cứu

Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến các Thầy Cô khoa CNSH, chúc các Thầy Cô gặt hái nhiều thành công trong cuộc sống và trên con đường giảng dạy

Xin chân thành cảm ơn !

Bình Dương, ngày 17 tháng 05 năm 2016 Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Ngọc Phượng

Gram (-) Gram âm Gram (+) Gram dương

NB Nutrient Broth OD Optical Density

PDA Potato Dextrose Agar P aeruginosa Pseudomonas aeruginosa S aureus Staphylococcus aureus S typhi Salmonella typhi T rubrum Trichophyton rubrum

TSA Trypticase Soy Agar TSB Trypticase Soy Broth

Hình 2 5: Bố trí thử nghiệm khuẩn kháng nấm gây bệnh 32

Hình 2 6: Quy trình thử kháng khuẩn của chủng vi nấm nội sinh 33

Hình 2 7: Bố trí thử nghiệm nấm kháng khuẩn gây bệnh 34

Hình 2 8: Quy trình thử nghiệm kháng nấm của chủng vi nấm nội sinh 35

Hình 2 9:Bố trí thử nghiệm nấm kháng nấm gây bệnh 36

Hình 3 1: Phân lập vi khuẩn nội sinh trên đĩa TSA 49

Hình 3 2: Hình ảnh quan sát đại thể và vi thể một số chủng vi khuẩn nội sinh 50

Hình 3 3: Kết quả phân lập vi nấm nội sinh cây cỏ hôi trên PDA 53

Hình 3 4: Hình ảnh quan sát đại thể và vi thể một số chủng vi nấm nội sinh 53

Hình 3 5: Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của chủng vi khuẩn nội sinh 56

Hình 3 6: Kết quả khả năng đối kháng qua dịch lọc vi khuẩn đối với vi khuẩn gây bệnh E Coli 58

Hình 3 7: Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuẩn sinh carbapenemase của chủng vi khuẩn nội sinh 61

Hình 3 8: Kết quả khả năng đối kháng qua dịch lọc vi khuẩn đối với vi khuẩn thử nghiệm Acinetobacter spp (41a) sinh carbapenemase 64

Hình 3 9: Kết quả khảo sát khả năng kháng vi nấm gây bệnh T rubrum của chủng vi khuẩn nội sinh 67

Hình 3 10: Kết quả khả năng đối kháng qua dịch lọc vi khuẩn đối với vi nấm gây bệnh T rubrum 68

Hình 3 11: Kết quả khảo sát khả năng kháng vi khuẩn sinh carbapenemase của vi

nấm nội sinh 69

Hình 3 12: Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm gây bệnh T rubrum của vi nấm nội sinh H5 71

Hình 3 13: Quan sát chủng nấm H3 trên môi trường PDA 73

Hình 3 14: Quan sát chủng nấm H3 dưới kính hiển vi 74

Hình 1: Thử nghiệm Citrate, Nitrate của chủng HL6 và HR2 93

Hình 2: Thử nghiệm MR, VP, Ure của chủng HL6 và HR2 93

Hình 3: Thử nghiệm Nitrate của chủng HL6 và HR2 93

Hình 4: Thử nghiệm lên men đường Glucose, Mannose, D-Xylose của chủng HL6 và HR2 94

Hình 5: Thử nghiệm lên men đường Salicin, D-cellobiose, D-melibiose, Rafinose của chủng HL6 và HR2 94

Hình 6: Thử nghiệm amylase của chủng HL6 và HR2 95

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 1: Các chỉ tiêu quan sát đại thể vi khuẩn trên thạch 23

Bảng 2 2: Các chỉ tiêu quan sát vi thể vi khuẩn trên kính hiển vi 24

Bảng 2 3: Các chỉ tiêu quan sát nấm sợi trên thạch 25

Bảng 2 4: Các chỉ tiêu quan sát vi thể nấm sợi 25

Bảng 3 1: Kết quả phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi 44

Bảng 3 2: Kết quả quan sát đại thể, vi thể các chủng vi khuẩn nội sinh 45

Bảng 3 3: Kết quả khảo sát đại thể và vi thể vi nấm nội sinh từ cây cỏ hôi 50

Bảng 3 4: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh của chủng vi khuẩn nội sinh 53

Bảng 3 5: Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch lọc các vi khuẩn nội sinh đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh 56

Bảng 3 6: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn sinh carbapenemase của chủng vi khuẩn nội sinh 59

Bảng 3 7: Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch lọc các vi khuẩn nội sinh đối với các chủng vi khuẩn sinh enzym carbapenemase 62

Bảng 3 8: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng nấm gây bệnh của chủng vi khuẩn nội sinh 65

Bảng 3 9: Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch lọc các vi khuẩn nội sinh đối với chủng vi nấm gây bệnh T rubrum 67

Bảng 3 11: Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm bệnh Trichophyton rubrum 69

Bảng 3 12: Kết quả các chủng vi nấm nội sinh kháng T rubrum 70

Bảng 3 13: Kết quả khảo sát đại thể, vi thể chủng HR2, HL6 71

Bảng 3 14: Kết quả định danh sinh hóa chủng HR2 và HL6 72

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3 1: Khả năng kháng khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn nội sinh 57Biểu đồ 3 2: Khả năng kháng khuẩn sinh carbapenemase của các chủng vi khuẩn nội sinh 63Biểu đồ 3 3: Khả năng kháng nấm gây bệnh T rubrum của các chủng vi khuẩn nội sinh 68Biểu đồ 3 4: Kết quả khảo sát hoạt tính kháng chủng vi nấm gây bệnh T rubrum của các chủng vi nấm nội sinh 70

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 SƠ LƯỢC VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH 5

1.1.1 Vi sinh vật nội sinh 5

1.1.2 Một số vai trò của vi sinh vật nội sinh 5

1.1.3 Phân loại vi sinh vật nội sinh 6

1.2 TỔNG QUAN CÂY CỎ HÔI 6

1.2.1 Khái quát về họ cúc (Compositae) 6

1.2.2 Khái quát về cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides L) 7

1.3.4 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 12

1.3.5 Vi khuẩn Salmonella typhi 12

1.3.6 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 13

1.4 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI NẤM GÂY BỆNH CHO NGƯỜI 14

Tổng quan vi nấm nghiên cứu Trichophyton rubrum 15

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 15

1.5.1 Nghiên cứu trong nước 15

1.5.2 Nghiên cứu ngoài nước 16

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 19

2.2 VẬT LIỆU 19

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ, môi trường 19

2.3 Phương pháp thí nghiệm 20

2.3.1 Bố trí thí nghiệm 20

2.3.2 Phương pháp phân lập vi sinh vật nội sinh 21

2.3.3 Đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh của chủng vi sinh vật nội sinh phân lập 27

PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 44

3.1.1 Kết quả giám định tên khoa học của cây 44

3.1.2 Kết quả phân lập vi sinh vật nội sinh từ cây cỏ hôi 44

3.1.3 Kết quả đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh của chủng vi sinh nội sinh phân lập từ cây cỏ hôi 53

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh nhiễm trùng là một trong những nguyên nhân hàng đầu mắc phải và tử vong trên toàn thế giới, đặc biệt là ở các nước phát triển (Zeigler, 2005; Yala và cs, 2001) Vào thế kỉ XX, kháng sinh đã trở thành một trong những thứ vũ khí hữu hiệu nhất trong việc chống lại vi khuẩn và các bệnh nhiễm khuẩn do chúng gây ra

Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) hơn 80% dân số thế giới dựa trên y học cổ truyền để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe cho chính mình (Vashist và Jindal, 2012) đặc biệt là trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, vi nấm gây ra Vấn đề hiện nay là vi sinh vật kháng thuốc và đa kháng thuốc ngày càng phổ biến và nghiêm trọng Vì vậy, việc tìm ra nguồn thuốc mới thay thế cho các thuốc đang sử dụng trở nên cấp thiết trong đó thực vật và vi sinh vật nội sinh là những nguồn đầy tiềm năng đang được quan tâm

Vi sinh vật nội sinh thực vật được tìm thấy trong hầu hết các loài thực vật, chúng cư trú ở trong mô của thực vật và giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác nhau như cộng sinh tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh (Compant và cs., 2005) Và một số nghiên cứu trước đây đã cho thấy rằng, vi sinh vật nội sinh cây dược liệu có khả năng sinh ra các chất có khả năng ứng dụng để sản xuất kháng sinh, đó là nguồn chất kháng khuẩn, kháng nấm có tiềm năng quan trọng dùng cho việc phòng trị các loại vi nấm và vi khuẩn gây bệnh (Ryan và cs, 2008)

Cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides) là dược liệu phổ biến ở nước ta Các công trình

nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây cỏ hôi cho thấy loài cây này có tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, làm giảm đau và hạ sốt Năm 1965, Điều Ngọc Thực ở Phú Thọ đã ứng dụng cây cỏ hôi chữa viêm xoang mũi dị ứng cho bản thân và một số người khác thấy có kết quả tốt Trên cơ sở thực tế kết quả lâm sàng, Đoàn Thị Nhu và cộng sự (1975) đã xác định độc tính cấp LD-50 bằng đường uống là 82g/kg Với liều độ bán mãn dùng trong 30 ngày không thấy gây những biến đổi bất thường đối với các hằng số sinh hóa trong một số xét nghiệm về chức năng gan và thận

Từ những lợi ích nêu trên của cây cỏ hôi và các ứng dụng rộng lớn của vi sinh vật

nội sinh, nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “PHÂNLẬPVISINHVẬTNỘISINHTỪCÂYCỎHÔI (AGERATUMCONYZOIDES) VÀKHẢOSÁTKHẢNĂNGĐỐIKHÁNGVỚIMỘTSỐVISINHVẬTGÂYBỆNH”

Mục tiêu:

Tạo ra bộ sưu tập vi sinh vật nội sinh cây dược liệu Ageratum conyzoides có khả

năng đối kháng với một số vi sinh vật gây bệnh

Nội dung thực hiện đề tài:

Thu thập mẫu cây dược liệu (lá, thân cây cỏ hôi)

Phân lập và làm thuần các vi sinh vật nội sinh phân lập được trên cây dược liệu Khảo sát khả năng đối kháng với một số vi sinh vật gây bệnh

Định danh những chủng vi sinh vật nội sinh

Kết luận, nhận xét, đánh giá kết quả và viết báo cáo

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SƠ LƯỢC VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH

1.1.1 Vi sinh vật nội sinh

Thuật ngữ “endophytic” bao gồm các vi sinh vật phát triển bên trong các mô của thực vật bậc cao, không gây ra tác hại trên cây kí chủ mà nó đang tồn tại và đã được chứng minh là nguồn sản phẩm tự nhiên phong phú có hoạt tính sinh học (Li và cs., 2008; Tan và Zou, 2001) Tương tác hỗ sinh giữa vi sinh vật và cây chủ đem đến lợi ích cho cả hai bên (Kogel và cs., 2006) Các vi sinh vật này có thể sản xuất một loạt các hợp chất khác nhau nhằm cung cấp, bảo vệ và là điều kiện sống của cây chủ Các hợp chất được cô lập có thể có tiềm năng sử dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và y tế (Strobel, 2003) Năm 2000, Kobayashi và Palumbo đã biên soạn một danh sách 55 giống và 144 loài nội sinh phân lập từ rễ, thân, hoa, hạt, quả của nhiều loài thực vật (Kobayashi và Palumbo, 2000)

Các vi sinh vật nội sinh thường gặp nhất là nấm và vi khuẩn (bao gồm cả xạ khuẩn) Cả vi khuẩn nội sinh và nấm nội sinh có thể cùng tồn tại trong một cây chủ duy nhất (Ting và cs., 2009) Vi sinh vật nội sinh được coi là một tập con của quần thể vi sinh vật (Germida và cs.,1998)

Vi sinh vật nội sinh hiện đang được nghiên cứu rộng rãi như là nguồn sản phẩm hoạt tính sinh học mới, mở ra một cơ hội để khám phá các hợp chất mới và các nguồn lực công nghệ sinh học có tiềm năng có thể khai thác (Sivaramakrishnan và cs., 2006) và có tiềm năng sử dụng của chúng trong nhiều lĩnh vực (Strobel, 2003)

1.1.2 Một số vai trò của vi sinh vật nội sinh

Vi sinh vật nội sinh sống trong mô thực vật được tìm thấy ở vùng rễ, rễ, thân, lá, quả của thực vật Vùng rễ là nơi xuất phát nhiều vi khuẩn nội sinh chui vào rễ, thân, lá để sống nội sinh; sau khi xâm nhập vào cây chủ có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hoặc di chuyển đi khắp nơi trong cây đến các hệ mạch của rễ, thân, lá, hoa (Zinniel và cs, 2002), thúc đẩy các quá trình chuyển hóa trong cây, sự phát triển lông rễ một cách mạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ (Harari và cs, 1988)

Sau khi đã cư trú trong các mô thực vật, vi sinh vật nội sinh sẽ sản xuất các sản phẩm tự nhiên đa dạng mà có thể là một nguồn tiềm năng của thuốc kháng sinh mới

Các sản phẩm tự nhiên thu được từ vi khuẩn nội sinh là các chất kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư, chống oxy hóa, tiểu đường và ức chế miễn dịch (Christina và cs., 2013)

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi sinh vật nội sinh có khả năng kiểm soát mầm bệnh trên thực vật Năm 2009, Gazis và cộng sự đã phân lập vi khuẩn nội sinh mới

kiểm soát sinh học chống lại các tác nhân gây bệnh rụng lá trên cây cao su (Hevea

brasiliensis) tại Peru Trong một số trường hợp chúng đẩy mạnh tốc độ nảy mầm của

hạt, thúc đẩy sự hình thành cây con trong điều kiện bất lợi và nâng cao khả năng tăng trưởng của thực vật (Chanway, 1997) Bên cạnh đó, vi sinh vật nội sinh còn có khả năng ngăn chặn mầm bệnh phát triển bằng cách tổng hợp các chất nội sinh trung gian, qua đó để tiếp tục tổng hợp các chất chuyển hóa và các hợp chất hữu cơ mới Nghiên cứu chế phẩm sản sinh chất chuyển hóa mới trong sự đa dạng sinh học của vi sinh vật nội sinh có thể phát hiện các loại thuốc mới để điều trị có hiệu quả cả bệnh ở người, thực vật và động vật (Strobel và cs., 2003)

1.1.3 Phân loại vi sinh vật nội sinh

Vi sinh vật nội sinh được chia thành hai loại chính: vi sinh vật nội sinh bắt buộc và vi sinh vật nội sinh tuỳ ý Vi sinh vật nội sinh tuỳ ý có khả năng tồn tại trong đất, trên bề mặt cây trồng, bên trong thực vật cũng như trên các chất dinh dưỡng nhân tạo (Baldani và cs., 1997) và vi sinh vật sống bên trong mô thực vật trong suốt vòng đời của chúng được gọi là vi sinh vật nội sinh bắt buộc (Stoltzfus và cs., 2000) Vi sinh vật nội sinh tuỳ ý được phân bố rộng rãi trên toàn giới thực vật và có thể được phân lập từ các loài thực vật khác nhau Vi sinh vật nội sinh cũng được báo cáo là có ở cả một số loài thực vật và cây con nuôi cấy in vitro

Trên thế giới có vô số loài thực vật với số lượng khổng lồ, có khoảng 300.000 loài thực vật tồn tại trên Trái Đất, mỗi loài là một ký chủ cho một đến nhiều các dạng nội sinh cư trú, do đó không thể đưa vào thí nghiệm một cách chủ quan hay ngẫu nhiên Vì vậy, cần có nguyên tắc lựa chọn nhất định, phù hợp với mục đích để có được nguồn vi sinh vật nội sinh hữu ích, có tính ứng dụng cao (Strobel và cs., 2003)

1.2 TỔNG QUAN CÂY CỎ HÔI

1.2.1 Khái quát về họ cúc (Compositae)

Họ Cúc (Compositae) là một trong những họ lớn nhất, phân bố rộng rãi nhất, bao

gồm tới 10.000 chi và 20.000 loài phân bố trên toàn thế giới ở mọi địa hình và khí hậu khác nhau, nhất là vùng khí hậu nhiệt đới và ôn đới ở Việt Nam, có 125 chi và 350 loài phân bố khắp mọi nơi từ cực Nam đến cực Bắc của đất nước (Hoàng Thị Sản, 2003)

Các cây họ Cúc thường thuộc loại thảo, ít khi là cây to, rể cây thường phồng lên thành củ, lá đơn và thường mọc so le, ít khi mọc đối, có khi thành hình hoa thị, không có lá kèm, phiến lá ít khi nguyên, thường khứa răng hay chia thùy Cụm hoa đầu gồm nhiều hoa, mọc những kẻ ở vảy và bao bọc bởi một tổng bao lá hắc Hoa có thể đều hình ống hay không đều, hình lới nhỏ 5 cánh hoa liền nhau thành một tràng hình ống hay hình lỡi nhỏ Năm nhị dưới liền nhau bởi bao phấn thành một ống Hai lá noãn, bầu hạ một ô đựng một noãn vòi dài đầu nhụy xẻ đôi có lông thu, quả bế nhiều khi có mào lông hay có móc, hạt không có nội nhủ Một số cây có ống nhựa mủ, một số khác có ống tiết Chất dự trữ trong củ là insulin (Nguyễn Thị Diễm Trang, 1973) Ở nước ta, các chi có nhiều loài nhất là Blumea, Vernonia, Latuca, Eupatoreum, Ginura, Senecio, Artemisia, Crepis và Ainsliaea Gần đây một số chi họ Cúc ở Việt Nam đã được nghiên cứu nhiều như: Artemisia, Ageratum, Eupatorium và Blumea F Bohlman và các cộng sự đã nghiên cứu các loại thực vật họ Cúc ở Châu Âu, ở Trung và Nam Mỹ và một số vùng ở Nam Phi

1.2.2 Khái quát về cây cỏ hôi (Ageratum conyzoides L)

1.2.2.1 Phân loại thực vật

Giới (regnum) Plantae Ngành (division) Tracheophyta Lớp (class) Magnoliopsida Bộ (ordo) Asterales Họ (familia) Asteraceae Chi (genus) Ageratum

Loài (species) Ageratum conyzoides L

Hình 1 1: Cây Cỏ hôi (Ageratum conyzoides L.)

Cây Cỏ hôi: còn gọi cây bù xích, cỏ hôi, cây ngũ sắc; Tên khoa học: Ageratum

conyzoides L, Thuộc họ Cúc – Compositae Cây Cỏ hôi là cây bắt nguồn từ tiếng Hi

Lạp là Ageras có nghĩa là tồn tại lâu dài Họ này có khoảng 30 loài nhưng chỉ có một số ít được nghiên cứu về thành phần hoá học (Burkill, 1985)

1.2.2.2 Đặc điểm thực vật

Cây Cỏ hôi là cây nhiệt đới, rất phổ biến ở phía Tây một số vùng Châu Á và phía Nam Châu Mỹ Là cây thảo, sống hàng năm, cây cao xấp xỉ 1m, thân cây có lông mềm, lá mọc đối hình trứng hay ba cạnh, dài 2-6 cm; rộng 1- 3 cm, mép có răng ca tròn, 2 mặt lá đều có lông, mặt dưới của lá nhạt hơn Hoa có màu tía đến trắng, cánh hoa bé hơn 6 mm chéo nhau và sắp xếp kín ở phần cuối cụm hoa Quả bế, màu đen, có 5 sống dọc Hạt chỉ sống được ở nơi có ánh sáng và cây chết trong khoảng 12 tháng Là cây mọc ở vườn, nơi đất bỏ hoang, các bãi rác thải Độc tính của loại cây này chưa được nghiên cứu nhiều Tinh dầu của nó được thu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước, có mùi gây nôn, trong đó tìm thấy sự có mặt của HCN và cumarin Một loạt các hợp chất hóa học chứa alkaloid, flavonoid, chromenes, benzofurans và terpenoids đã được phân lập từ các loài này (Department of Biology, 2002) Cây Cỏ hôi từ lâu đã được sử dụng làm thuốc chữa bệnh cho người và gia súc

1.2.3 Dược lý và sử dụng

Cây Cỏ hôi được sử dụng ở các vùng khác nhau, ở châu Phi, châu Á và phía nam châu Mỹ dùng để chữa một số bệnh khác nhau Tuy nhiên, gần đây đã liệt kê được tác dụng của loại cây này đối với con người: sử dụng làm thuốc tẩy, thuốc giảm sốt,

chữa trị chổ loét, băng bó vết thương Hàm lượng thuốc giảm sốt nhiều nhất phải kể đến cây lấy từ Xênêgan Một số nước ở Châu Phi sử dụng cây này có tác dụng chữa một số bệnh về thần kinh, đau đầu, chữa trị vết thương do bị bỏng Ở Camarun cây này là phương thuốc truyền thống, lá của nó tán ra với nước cho ta một loại thuốc gây nôn và chữa bệnh viêm phổi bằng cách xát cây này lên ngực bệnh nhân Ở Nigeria nó được sử dụng để chữa bệnh ngoài da, nước sắc của cây có thể uống vào để chữa trị tiêu chảy và giảm đau ở rốn của trẻ em mới sinh Ở Kenya cây này là loại thuốc truyền thống dùng để chữa trị bệnh đau thắt, cầm máu có hiệu lực, còn ở Ấn Độ nó được sử dụng để chữa bệnh hủi, ngoài ra có tác dụng như một thứ dầu bôi ngoài da ở những vết thương có mủ Ở Việt Nam cây được sử dụng để chữa bệnh viêm xoang mũi, chữa bệnh rong huyết ở phụ nữ mới sinh, chữa bệnh thấp khớp, thuốc đau răng, thuốc ho, thuốc giun Ngoài ra một số người còn dùng nó để nấu nước gội đầu (Adewole-Okunade, 2000)

1.3 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI KHUẨN NGHIÊN CỨU

1.3.1 Vi khuẩn Acinetobacter spp

Acinetobacter spp là những vi khuẩn không lên men thường gặp trong phòng xét

nghiệm vi sinh lâm sàng

1.3.1.3 Khả năng gây bệnh

Trước đây Acinetobacter spp được coi là những vi khuẩn cơ hội, vai trò gây bệnh của chúng mới được chú trọng ở những năm gần đây Vi khuẩn Acinetobacter spp có thể gây nhiễm khuẩn bệnh viện với những bệnh nặng như viêm màng não, viêm nội tâm mạc, viêm phổi và nhiễm khuẩn huyết có khuynh hướng ngày càng gia tăng (Nguyễn Thanh Bảo, 2011)

1.3.2 Vi khuẩn Escherichia coli

1.3.2.1 Phân loại

Phân ngành Proteobacteria

Lớp Gamma Proteobacteria Bộ Enterobacteriales Họ Enterobacteriaceae Chi Escherichia

Loài Escherichia coli

(Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012)

1.3.2.2 Đặc điểm

E coli là trực khuẩn Gram âm Kích thước trung bình 2 – 3 μm x 0,5 μm; trong

những điều kiện không thích hợp (trong môi trường có kháng sinh), vi khuẩn có thể

dài như sợi chỉ Rất ít chủng E coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và có khả năng di

động

E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu khí tùy

nghi, nhiệt độ từ 5 – 400C Trong điều kiện thích hợp E coli phát triển rất nhanh, thời

gian thế hệ chỉ khoảng 20 – 30 phút

1.3.2.3 Khả năng gây bệnh

E coli là vi khuẩn thường trú đường tiêu hóa ở người, có thể được tìm thấy ở

đường hô hấp trên hay đường sinh dục E coli đứng đầu trong các vi khuẩn gây bệnh

tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật, căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết

E coli có khả năng gây bệnh khi xâm nhập vào những vị trí trong cơ thể mà bình

thường chúng không hiện diện

E coli có trong phân người khỏe mạnh chỉ gây bệnh khi có dị vật hay hệ thống

miễn dịch của ký chủ bị suy yếu E coli gây bệnh đường ruột Tác nhân gây bệnh qua

đường tiêu hóa khi ký chủ nuốt vào đủ số lượng vi khuẩn Truyền bệnh chủ yếu qua thức ăn hay nước uống bị nhiễm vi khuẩn hay truyền từ người này qua người khác (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012)

1.3.3 Vi khuẩn Klebsiella spp

Klebsiella spp là vi khuẩn thường trú ở đường ruột, chúng có mặt khắp nơi trong

tự nhiên như ở đất, nước, những thức ăn có hàm lượng đường và acid cao, các sản

phẩm thực vật Một số loài trong chi Klebsiella còn được phân lập từ bề mặt rễ của

một số loại thực vật với vai trò cố định nitơ Ở người, có thể tìm thấy chúng ở da, cổ họng, đường ruột, dạ dày, nước tiểu hay vết thương (Podschun và cs, 1998; Dworkin, 2006)

1.3.3.1 Phân loại

Klebsiella được phân loại như sau (Buchanan và Gibbons, 1994; Dworkin, 2006):

Giới Bacteria Ngành Proteobacteria

Lớp Gamma proteobacteria Bộ Enterobacteriales Họ Enterobacteriaceae Chi Klebsiella

Chi Klebsiella gồm các loài: K pneumoniae, K oytoca, K oaenae, K panticola,

K onithicrocytica, K rhinosclersmatis, K terrigena (Dworkin, 2006) Trong chi Klebsiella, K pneumoniae là thành viên quan trọng nhất về bệnh học và là một trong

những tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nghiêm trọng trong những năm gần đây (Podschun và cs, 1998)

1.3.3.2 Đặc điểm

Klebsiella spp là trực khuẩn Gram (-), không di động, có vỏ polysacharide đặc

trưng giúp vi khuẩn tránh được hàng rào phòng vệ của tế bào chủ (Podschun và cs, 1998)

Klebsiella spp có kích thước 0,3-1,5 μm × 0,6-6,0 μm, hình que, thường đứng

thành từng đôi, không sinh bào tử (Buchanan và Gibbons, 1994)

1.3.4 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

1.3.4.1 Phân loại

Phân ngành Proteobacteria

Lớp Gamma Proteobacteria Bộ Pseudomonadales Họ Pseudomonadaceae Chi Pseudomonas

Loài Pseudomonas aeruginosa

(Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012)

1.3.4.2 Đặc điểm

P aeruginosa là trực khuẩn mủ xanh, thẳng hoặc hơi cong nhưng không xoắn, hai

đầu tròn, dài 1 – 5 μm, rộng 0,5 – 1 μm, ít khi có vỏ có một ít lông ở một đầu, di động, không sinh nha bào, bắt màu Gram âm Chúng mọc ở biên độ nhiệt rộng (10 – 440C), tối ưu ở 350C Trong môi trường đặc hiệu, có thể gặp hai loại khuẩn lạc: một loại to, nhẵn, bờ trải dẹt, giữa lồi lên; một loại khác xù xì

1.3.4.3 Khả năng gây bệnh

Trực khuẩn mủ xanh là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện: khi cơ thể suy giảm miễn dịch, bệnh ác tính hay mãn tính, khi dùng corticoid lâu dài, việc dùng kháng sinh tùy tiện,… Gây nhiễm trùng da, mắt như viêm nang lông, viêm da chảy nước ở

các vùng kẽ hoặc viêm tai ngoài, viêm loét giác mạc, Ngoài ra, P aeruginosa là

căn nguyên gây nhiễm trùng vết bỏng, vết thương, xương khớp, dịch não tủy, tiết niệu và hô hấp

Trực khuẩn gây viêm mủ (mủ có màu xanh), khi có điều kiện thuận lợi chúng gây bệnh toàn thân như nhiễm khuẩn huyết hoặc viêm phế quản, viêm màng não, viêm tai giữa, viêm xương tủy (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012)

1.3.5.1 Phân loại

Phân ngành Proteobacteria

Lớp Gamma Proteobacteria Bộ Enterobacteriales Họ Enterobacteriaceae Chi Salmonella

Loài Salmonella typhi

(Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012)

1.3.5.2 Đặc điểm

S typhi là trực khuẩn Gram âm, có lông xung quanh thân, có khả năng di động,

không sinh nha bào Kích thước khoảng 0,4 – 0,6 x 2 – 3 μm S typhi là vi khuẩn hiếu

khí tùy nghi, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường Trong môi trường thích hợp sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước trung bình 2 – 4 mm

1.3.5.3 Khả năng gây bệnh

S typhi chỉ gây bệnh cho người, chủ yếu gây bệnh thương hàn Bệnh thương hàn

có thể gây biến chứng chủ yếu là xuất huyết tiêu hóa và thủng ruột Một số biến chứng ít gặp hơn như viêm màng não, viêm tủy xương, viêm khớp, viêm thận (Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012)

1.3.6 Vi khuẩn Staphylococcus aureus

1.3.6.1 Phân loại

Giới Prokaryote Phân ngành Firmicute Lớp Firmibacteria

Chi Staphylococcus

Loài Staphylococcus aureus

(Nguyễn Thanh Bảo, 2008; Lê Văn Phủng, 2012)

1.3.6.2 Đặc điểm

S aureus là vi khuẩn Gram dương, hình cầu, đường kính 0,5 – 1,5 μm; có thể

đứng riêng lẻ, từng đôi, từng chuỗi ngắn, hoặc từng chùm không đều giống chùm nho, không di động và không sinh bào tử, thường cư trú trên da và màng nhầy của

người và động vật máu nóng Trên môi trường Baird Parker, khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2 – 5 mm

1.3.6.3 Khả năng gậy bệnh

S aureus gây ra hai loại hội chứng nhiễm độc và nhiễm trùng:

Nhiễm độc có thể do hoạt tính của một hoặc một vài sản phẩm của S aureus (độc

tố) mà không cần có sự hiện diện của vi khuẩn Như hội chứng sốc nhiễm độc, hội chứng phỏng ngoài da, hội chứng ngộ độc thức ăn

Nhiễm trùng là do S aureus xâm nhập vào cơ quan bảo vệ của vật chủ khi bị tổn

thương hay giảm chức năng Như nhiễm trùng da và mô mềm, hệ hô hấp, hệ thần kinh trung ương, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng tiểu, nhiễm trùng nội mạch, xương,…

S aureus gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mủ và gây độc ở người Thường xảy

ra ở những chỗ xây xước trên bề mặt da như nhọt, gây ra nhiều bệnh truyền nhiễm nghiêm trọng như viêm phổi, viêm tĩnh mạch, viêm màng não, nhiễm trùng tiểu và những bệnh nguy hiểm khác như viêm xương tủy, viêm màng trong tim (Nguyễn Thanh Bảo, 2008)

1.4 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI NẤM GÂY BỆNH CHO NGƯỜI

Dermatophytes là nhóm nấm có quan hệ gần gũi với loại nấm có enzym karatinase và có thể gây ra nhiễm trùng trong các mô keratin của người và động vật (da, tóc, móng), dẫn đến một căn bệnh được gọi là Dermatophytosis, thường được gọi là bệnh

nấm ngoài da nhóm này bao gồm chi Epidermophyton, Trichophyton và

Microsporum, có khoảng 40 loài Tùy thuộc vào nguồn gốc của Keratin được sử dụng,

Dematophytes có thể được chia vào nhóm ưa đất (từ môi trường lây qua người qua vết trầy xước ở da), nhóm ưu động vật (sống ở súc vật lây qua người) và nhóm ưa con người (chỉ gây bệnh và lây trực tiếp người qua người) Đối với nhóm ưa đất, một số động vật và con người là môi trường sống chính của chúng

Bệnh nấm da thường được mang tên theo vị trí các phần khác nhau của cơ thể mà ở đó nấm ký sinh gây bệnh như nấm da đầu, nấm kẽ chân, nấm bẹn, nấm móng,

Nấm không xâm nhập vào các mô, tổ chức nhưng sự hiện diện của nấm cũng như các sản phẩm chuyển hóa của nấm có thể gây ra những phản ứng viêm, dị ứng với các hình thái và mức độ phụ thuộc vào tác nhân gây bệnh (Molina de Diego, 2011)

Phân loại nấm học (Weitzman và cs., 1995): Ngành Ascomycota Lớp Ascomycerstes Lớp phụ Pyronomycetes

Chi Microsporum và Trichophyton

Tổng quan vi nấm nghiên cứu Trichophyton rubrum

T rubrum thuộc chi Trichophyton spp Loài nấm này thường kí sinh ở vùng da

mịn và lông tơ, có nhiều loài, không hoặc sinh bào tử lớn rất ít Bào tử thường có hình điếu thuốc, thành mỏng và nhẵn, bên trong chia ra 3 – 8 vách ngăn Bào tử nhỏ hình thành nhiều, có thể dạng đơn hay tập trung thành từng chùm nho dọc theo sợi nấm

⮚ Đặc điểm

Loài nấm thường gây bệnh trên chó, trong giai đoạn này vùng bệnh tích dạng ban đỏ Trên đỉnh đầu, mũi, xung quanh mắt bị rụng lông, chân và tay có những đốm tròn không đều

Khuẩn lạc bắt đầu mọc sau 5 – 6 ngày nuôi cấy, mặt trên màu trắng như bông, mặt dưới khuẩn lạc màu đỏ tía Nấm sinh bào tử lớn hình chùy

⮚ Khả năng gây bệnh

T rubrum thường gây tổn thương mũi, đỉnh đầu, xung quanh mắt, chân tay có

những đốm tròn không đều, khi bệnh kéo dài vùng da bệnh bị nhiễm nấm phủ một lớp vảy xám

1.5.1 Nghiên cứu trong nước

Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự đã tiến hành phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ để khảo sát tinh dầu từ lá tươi cây cỏ hôi ở một vùng gần Hà Nội và đã xác định

ba thành phần chính là beta caryophylen, demethoxy ageratochromen, ageratochromen

Năm 2004, Đỗ Bích Huy và cộng sự đã chứng tỏ cây cỏ hôi có tác dụng ức chế miễn dịch và kháng histamin qua tác dụng gây teo tuyến ức chuột cống non một cách rõ rệt và tác dụng chống choáng, phản vệ đối kháng với tác dụng gây co bóp ruột cô lập của histamin trên chuột lang

1.5.2 Nghiên cứu ngoài nước

Năm 1998, ở Nigeria-châu Phi, Ekundayo và cộng sự, đã phân tích thành phần tinh dầu lá cây cỏ hôi có màu đỏ da cam bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) và xác định được tinh dầu gồm 51 cấu tử

Một số điều tra dược phẩm đã được tiến hành để xác định hiệu quả Duradola (1977) đã xác nhận hoạt tính ức chế các chất chiết xuất ether và chloroform chống lại

sự phát triển của S aureus trong ống nghiệm Almagboul và cs (1985), sử dụng methanol từ cây này, chứng minh tác động ức chế sự phát triển của S aureus, B

subtilis, E coli và P aeruginosa Bioka và cs (1993) báo cáo hành động giảm đau

hiệu quả ở chuột bằng cách sử dụng chiết xuất từ dung dịch nước của A conyzoides

lá (100-400 mg / kg) Xét nghiệm thực hiện trong Kenia, với dung dịch chiết xuất của toàn bộ cây, chứng minh hoạt động cơ bắp thư giãn, xác nhận sử dụng phổ biến của nó như là một antispasmotic (Achola và cs, 1994)

Tại Brazil, xét nghiệm được tiến hành bởi Đại học Bang Campinas và Đại học Liên bang Paraiba) cho thấy kết quả đầy hứa hẹn Marques Neto và cs (1988) trong các thử nghiệm phòng khám với bệnh nhân bị hư khớp, tiêm dung dịch chiết xuất của toàn bộ cây, và báo cáo tác dụng giảm đau trong 66% bệnh nhân và cải thiện tính di động khớp ở 24%, không có tác dụng phụ Mattos (1988), sử dụng dung dịch chiết xuất từ của toàn bộ cây, xác minh kiểm soát hiệu quả lâm sàng của khớp, báo cáo giảm đau và viêm hoặc cải thiện tính di động khớp, sau một tuần điều trị

Cây cỏ hôi có hoạt tính sinh học có thể có sử dụng nông nghiệp, thể hiện qua một số cuộc điều tra nghiên cứu ở các nước khác nhau Pereira vào năm 1929, trích dẫn bởi Jaccoud (1961), báo cáo sử dụng của lá cây này như một con côn trùng (bướm) Các hoạt động diệt côn trùng được coi là hoạt động sinh học quan trọng nhất của loài

này Các hợp chất tecpen, chủ yếu precocenes, với các hoạt động nội tiết tố antijuvenile của chúng có hiệu ứng giống thuốc trừ sâu

Loài này còn có khả năng sử dụng trong việc kiểm soát sâu bệnh khác Shabana và cs (1990), sử dụng dung dịch chiết xuất từ cây này, xác minh giảm ấu trùng Meloidogyne incognita xuất hiện của Pu và cs (1990) Sự hiện diện của cây cỏ hôi cũng có thể được sử dụng như một chất ức chế hạt giống, giảm sự phát triển của nhiều loại cây cỏ ở Nepal, Jha và Dhakal (1990)

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện trong thời gian từ 10/2015– 05/2016 tại phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh (cơ sở 3), 68 Lê Thị Trung, TP Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương

2.2 VẬT LIỆU

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu rễ, thân và lá cây cỏ hôi khỏe mạnh được thu hái từ thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương và quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh

Các chủng vi khuẩn, vi nấm gây bệnh được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh Trường Đại học Mở – Tp Hồ Chí Minh, gồm các chủng:

− Vi khuẩn gây bệnh thông thường: E coli, S aureus, S typhi, P.aeruginosa − Vi nấm gây bệnh thông thường: T rubrum

Chủng vi khuẩn sinh enzym carbapenemase được cung cấp bởi Khoa Xét Nghiệm, Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ, môi trường 2.2.2.1 Thiết bị

Tủ cấy vô trùng, nồi hấp (autoclave), kính hiển vi, tủ sấy, tủ lạnh, tủ ấm, microwave, cân phân tích, máy ly tâm, bộ lọc,…

− Môi trường Simmon’s citrate − Môi trường Nitrate

− Môi trường Clark – lubs − Môi trường tinh bột

− Môi trường thạch bán lỏng di động ⮚ Hóa chất:

− Cloramphenicol 0,05 % − Ethanol 700, ethanol 960 − Sodium hypochlorite 5 %

− Thuốc nhuộm tím kết tinh (Crystal violet) − Thuốc nhuộm Lugol

− Thuốc nhộm Safranin O − Thuốc nhuộm Lactophenol

− Thuốc thử: Dung dịch α – naphthon 5 %, dung dịch KOH 40 %, Gress A (acid sulfanilic), Gress B (α – naphthylamin), Kovac’s, H2O2 5 %,

2.3.1 Bố trí thí nghiệm

Mẫu cây cỏ hôi khỏe mạnh Xác định tên khoa học cây thuốc

Hình 2 1: Quy trình bố trí thí nghiệm 2.3.2 Phương pháp phân lập vi sinh vật nội sinh

2.3.2.1 Lấy mẫu

Mẫu cây cỏ hôi được chọn là những cây khỏe mạnh, lá xanh tốt, không mắc bệnh và tăng trưởng tốt Nên chọn những cây có cảm quan tối ưu nhất tại vị trí lấy mẫu (Roy và cs., 2010) Sau khi lấy mẫu được gửi định danh tại trường đại học Khoa Học Tự Nhiên

Lấy mẫu: mẫu được thu ở lúc sáng sớm hay chiều mát, thu toàn bộ cây rồi rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân và lá; sau đó cắt rời rễ và thân cây ra

Xử lý mẫu: để loại trừ các vi sinh vật có khả năng còn bám ở bề mặt, mẫu sau khi thu thập được tiến hành xử lý như sau: rửa sạch phần thân, rễ và lá dưới vòi nước mạnh; tiếp tục rửa lại bằng nước cất vô trùng rồi cắt rễ và thân thành những đoạn nhỏ 1-2 cm, cắt lá thành những hình vuông có kích thước 1 x 1 cm làm khô mẫu bằng giấy hút ẩm vô trùng; sau đó lần lượt khử trùng mẫu (rễ, thân, lá) bằng cồn 70 % trong 1 phút, sodium hypochloride 2,5 % trong 4 phút, ethanol trong 30 giây và rửa lại với nước cất vô trùng 4 lần để tẩy rửa các loại hóa chất còn thừa (Costa và cs., 2012)

Để kiểm tra khả năng các vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt mẫu sau khi khử trùng, lấy 200 μL nước cất vô trùng đã rửa mẫu ở lần thứ 4 (lần cuối) cấy lên các đĩa môi trường TSA và ủ ở 370C, nếu sau 24 giờ ủ các đĩa môi trường này không có sự xuất hiện các khuẩn lạc thì các mẫu đã khử trùng đạt yêu cầu (Costa và cs., 2012)

2.3.2.3 Phân lập

⮚ Phân lập vi khuẩn nội sinh

Mẫu sau khi mẫu đã xử lý xong, tiến hành phân lập trên môi trường Trypticase Soy Agar (TSA) ủ 300C trong điều kiện có ánh sáng trong 48 giờ để cho sự phát triển của vi khuẩn nội sinh (Roy và cs., 2010)

⮚ Phân lập vi nấm nội sinh

Phương pháp tiến hành: cắt nhỏ mẫu lá sau khi được xử lý, tiến hành phân lập trên môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) có bổ sung kháng sinh cloramphenicol 0,05 % và bọc kín parafilm ủ ở 27 ± 20C từ vài ngày cho đến 2 tháng để cho sự phát triển của vi nấm nội sinh (Kafur, 2011; Idris, 2013)

2.3.2.4 Làm thuần

⮚ Đối với vi khuẩn nội sinh

Sau khi ủ, khuẩn lạc có hình thái khác nhau đã được lựa chọn và tiến hành cấy ria nhiều lần trên đĩa NA và ủ ở 280C trong 48 giờ để làm thuần vi khuẩn nội sinh Tiến hành cấy ria nhiều lần trên môi trường NA cho đến khi thu được khuẩn lạc có độ đồng đều về hình dạng, màu sắc Quan sát, nhận xét về đặc điểm hình thái như: màu sắc, hình dạng, kích thước, viền, bề mặt của khuẩn lạc (Arunachalam và cs., 2010)

Lưu ý, từ một khuẩn lạc lấy từ mẫu thí nghiệm ta có thể có được ít nhất một chủng nội sinh

Các chủng đã được làm thuần được cấy giữ chủng vào các ống thạch nghiêng NA và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C (Arunachalam và cs., 2010) Từ các khuẩn lạc trên mẫu lá phân lập được ít nhất 1 chủng vi sinh vật nội sinh (Phạm Quang Thu và cs., 2012)

⮚ Đối với vi nấm nội sinh

Ghi nhận lại hình dạng, màu sắc, kết quả vi nấm nội sinh

Sau đó tiến hành tách khuẩn lạc vi nấm và cấy từ các đĩa mọc lên từ lần phân lập đầu tiên lên môi trường PDA, lặp lại cho đến khi thu được khuẩn lạc vi khuẩn và sợi nấm thuần khiết có độ đồng đều về hình dạng và màu sắc (Roy và cs., 2010; Kafur và cs., 2011) Từ các khuẩn lạc trên mẫu lá phân lập được ít nhất 1 chủng vi sinh vật nội sinh (Phạm Quang Thu và cs., 2012)

2.3.2.5 Quan sát đại thể, vi thể

⮚ Đối với vi khuẩn nội sinh

Xác định đặc điểm hình thái: hình dạng, kích thước và màu sắc của khuẩn lạc

Bảng 2 1: Các chỉ tiêu quan sát đại thể vi khuẩn trên thạch

Hình dạng Hình dáng mép (tròn, răng cưa,…), có

núm hay không

Kích thước Độ dày, đường kính…

Độ trong, màu sắc Trên, dưới, có hay không khuếch tán ra môi trường xung quanh

Mùi khuẩn lạc Có/ không mùi Khả năng sinh sắc tố huỳnh quang Có/ không

Nhuộm Gam, quan sát các chủng vi khuẩn phân lập được dưới kính hiển vi (Arunachalam và cs., 2010)

Nhuộm Gram: nhằm xác định hình dạng tế bào vi khuẩn, dạng cầu hay trực, quan sát cách sắp xếp dạng đơn lẻ, dạng chuỗi hay chùm và phân biệt tính chất bắt màu Gram (–) hoặc Gram (+) Cách tiến hành:

Đặt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ U Nhuộm bằng dung dịch crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô Nhuộm lại bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

Tẩy màu bằng cồn 96o, khoảng 15 - 20 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô

Nhuộm bổ sung bằng dung dịch safranin trong 30 giây, rửa nước, thấm khô Quan sát bằng vật kính dầu, độ phóng đại 1.000 lần

Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím crystal violet, vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng safranin

Bảng 2 2: Các chỉ tiêu quan sát vi thể vi khuẩn trên kính hiển vi Các chỉ tiêu đánh giá Mô tả

Hình thái Trực, cầu, chùy Cách sắp xếp Riêng lẻ, chuỗi, tụ,… Bào tử Có không

Cách bắt màu Tím, hồng

⮚ Đối với vi nấm nội sinh:

Khảo sát đại thể: bằng mắt thường, hay dùng kính lúp cầm tay nhận xét về kích thước, màu sắc,… của khuẩn lạc vi nấm nội sinh

Quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên thạch và kính hiển vi (Nguyễn Đức Lượng và cs., 2003; Nguyễn Lân Dũng và cs., 2006):

Bảng 2 3: Các chỉ tiêu quan sát nấm sợi trên thạch

Hình dáng Tròn,…

Kích thước Đường kính, chiều dày

Dạng bề mặt Nhung mượt, mịn, len xốp, dạng hạt, lồi lõm, có khía hay không,…

Màu sắc khuẩn lạc mặt trên

và mặt dưới Vàng, đỏ, đen, nâu, xám,… Dạng mép khuẩn lạc Mỏng, dày, phẳng, nhăn nheo,… Giọt tiết (nếu có) Nhiều, ít, màu sắc

Mùi khuẩn lạc Có/ không mùi

Sắc tố hoà tan Màu của môi trường xung quanh khuẩn lạc (nếu có)

Các cấu trúc khác Bó sợi, bó giá, các cấu trúc mang bào tử trần như: đĩa giá hoặc túi giá, đệm nấm, hạch nấm,

Khảo sát vi thể: để quan sát vi nấm nội sinh ta tiến hành làm tiêu bản nấm mốc, quan sát hình thái học dưới kính hiển vi ở vật kính 10X, 40X

Bảng 2 4: Các chỉ tiêu quan sát vi thể nấm sợi

Đặc điểm của sợi nấm Màu sắc, có vách ngăn hay không có vách ngăn

Đặc điểm của cơ quan sinh sản Hình dạng, cách sắp xếp các bộ phận của cơ quan sinh sản

Bào tử Hình dạng, cấu tạo, cách sắp xếp của bào tử

Làm tiêu bản nhuộm nấm, tiến hành theo các cách sau: ✔ Cách 1

Lấy một lam kính sạch, trong, đã sấy khô Nhỏ 1 giọt lactophenol lên giữa lam kính Dùng que cấy nhọn đầu lấy một phần khóm nấm mọc trên đĩa thạch môi trường PDA (cả phần mọc trên và dưới mặt thạch) để vào giọt dung dịch lactophenol Dùng

kim có cán hay que cấy nhọn dìm nấm vào giọt dung dịch lactophenol để thấm ướt Khi nấm bị thấm ướt hoàn toàn thì đậy lá kính (lamen) lên trên và ép nhẹ

Tiến hành quan sát với vật kính 10X, 40X Lưu ý:

− Khi đậy lá kính đừng để có bọt khí, nếu có sẽ gặp khó khăn trong khi soi kính

− Khi ép nhẹ lá kính tránh làm vỡ, nên dùng giấy thấm bớt dung dịch lactophenol thừa để dung dịch không tràn lên trên mặt lá kính

− Phương pháp này dùng trong trường hợp cần quan sát ngay các mẫu nấm mốc

✔ Cách 2

Lấy một lam kính sạch, trong, đã sấy khô Cắt một khung giấy lọc hình vuông cạnh 2 cm và có độ dày của cạnh khung là 0,3 cm Đặt khung giấy lên giữa lam kính rồi bơm dịch môi trường PDA bán lỏng (0,1 – 0,3 % agar) (khoảng 10 μL) lên lam kính vào giữa khung giấy Tiếp đến cấy nấm lên trên môi trường vừa mới bơm vào (cấy đơn bào tử hay cấy đỉnh sợi nấm) Đậy lamen lên và đặt lên thanh chữ U trong buồng ẩm (ở đây sử dụng đĩa petri bên trong có chứa bông gòn ướt bên trên có đặt thanh chữ U bằng thủy tinh) Để trong hơn 2 ngày, lấy lam kính ra bỏ khung giấy lọc, tiến hành nhuộm bằng lactophenol

Tiến hành quan sát với vật kính 10X, 40X

2.3.2.6 Giữ giống

Giữ giống vi sinh vật là công việc hết sức cần thiết do chúng dễ bị thoái hoá nếu không được bảo quản đúng kỹ thuật Công việc giữ giống là thực hiện các kỹ thuật cần thiết để giữ cho vi sinh vật có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật lạ

Sau khi thu được các chủng thuần, đem giữ giống trong môi trường thích hợp, đối với vi khuẩn nội sinh giữ giống trên môi trường NA và trên môi trường PDA đối với vi nấm bằng phương pháp cấy chuyền định kì, nên cấy chuyền thường xuyên (vài tuần hoặc một vài tháng tùy giống vi sinh vật) và có sổ ghi chép để tiện theo dõi

2.3.3 Đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh của chủng vi sinh vật nội sinh phân lập

2.3.3.1 Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng giữa vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn gây bệnh

Quy trình thử kháng khuẩn: tiến hành thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch Mueller Hinton (Roy và cs., 2010)

Hình 2 2:Quy trình khảo sát khả năng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn nội sinh

Vi khuẩn nội sinh phân lập Giống vi khuẩn gây bệnh

Chọn 3 – 5 khóm khuẩn, pha loãng bằng nước muối sinh lý

0,85 % tương đương 0.5 McFarland (OD = 0,08 – 0,1;

bước sóng 625 nm) mật độ đạt 1 x 108 CFU/ mL, pha

loãng đến 106 CFU/ mL

Trải khuẩn trên mặt thạch môi trường NA Tăng sinh trên môi trường

NB, nuôi lắc, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 – 5 ngày

Ly tâm môi trường nuôi cấy ở 8000 vòng/ phút trong 15 phút, thu dịch khuẩn ở 40C, lọc qua màng lọc 0,45 μm

Đục lỗ thạch đường kính 7 mm bằng dụng cụ vô trùng

Quan sát, xác định đường kính vòng kháng Cấy chuyển lên NA

Ủ 370C/ 24 giờ

Thêm vào giếng thạch (80 – 100 μL)

Ủ 37oC/ 18 – 24 giờ

Thuyết minh quy trình ⮚ Môi trường chuẩn bị

Môi trường NB và môi trường NA thử nghiệm được hấp vô trùng ở 1210C trong 20 phút, môi trường NA được đổ vào đĩa petri (đường kính 90 mm) với thể tích 20 mL

⮚ Chuẩn bị dịch vi khuẩn nội sinh thử nghiệm

Chủng vi khuẩn được cấy ria vào môi trường thạch NA, ủ 24 giờ ở 370C Chọn 1 khuẩn lạc đơn, cấy tăng sinh vi sinh vật nội sinh vào 30 mL môi trường NB, ủ ở 320C trong 3 – 5 ngày Tiến hành ly tâm môi trường nuôi cấy ở 8000 vòng/ phút trong 15 phút, thu dịch khuẩn ở 40C; đối với phương pháp khảo sát dịch lọc thì tiếp tục lọc dich ly tâm qua màng lọc 0,45 μm

⮚ Chuẩn bị dịch vi khuẩn gây bệnh

Lấy khoảng 3 – 5 khóm vi khuẩn có đường kính ≥ 1 mm trên đĩa thạch đã được cấy hoạt hóa 18 – 24 giờ để pha thành dịch treo trong nước muối sinh lý 0,85 % Vortex dịch khuẩn trong 20 giây Độ đục của huyền dịch vi khuẩn được so sánh với độ đục chuẩn 0,5 McFarland dưới nền giấy trắng có kẻ vạch đen Độ đục của 0,5 McFarland (OD625 nm = 0,08 – 0,1) mật độ đạt 108 CFU/ mL Tiếp tục pha loãng 100 lần huyền dịch bằng nước muối sinh lý để được huyền dịch vi khuẩn có nồng độ 106

CFU/ mL

⮚ Phương pháp tiến hành

Trong vòng 15 phút sau khi pha huyền dịch vi khuẩn gây bệnh, dùng tăm bông vô trùng nhúng vào huyền dịch rồi lấy lên ép và xoay tăm bông trên thành ống nghiệm cho ráo nước, trải đều vi khuẩn trên đĩa thạch môi trường NA, tiếp tục xoay mặt thạch 600 rồi trải tương tự, tiếp tục như vậy để đảm bảo trải đầy được vi khuẩn Khi mặt thạch khô, tiến hành đục lỗ thạch đường kính 7 mm bằng dụng cụ đục vô trùng, dịch vi khuẩn nội sinh được thêm vào trong mỗi giếng thạch khoảng 80 – 100 μL, để yên khoảng 15 phút cho dịch vi khuẩn khuếch tán vào lớp thạch Ủ ở 370C trong 18 đến 24 giờ Tương tự làm đĩa đối chứng bơm nước muối sinh lý 0,85 % vào giếng thạch

⮚ Đọc kết quả:

Vi khuẩn thử nghiệm có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh khi xung quanh lỗ có vòng kháng khuẩn (tính bằng đường kính vòng – mm)

Hình 2 3: Bố trí thử nghiệm khuẩn kháng khuẩn gây bệnh

2.3.3.2 Phương pháp thử đối kháng giữa vi khuẩn nội sinh và vi nấm gây bệnh

Quy trình thử kháng nấm: tiến hành thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch Mueller Hinton (Roy và cs., 2010; Rong – lin He và cs., 2009)

Vòng kháng khuẩn

Hình 2 4: Quy trình khảo sát khả năng kháng nấm gây bệnh của chủng vi khuẩn nội sinh

Vi khuẩn nội sinh phân lập Giống vi nấm gây bệnh

Cấy chuyển lên NA, ủ 24 giờ ở 370C

Tăng sinh trên môi trường NB, nuôi lắc, ủ ở 280C

trong 3 – 5 ngày

Ly tâm môi trường nuôi cấy ở 8000 vòng/ phút trong 15 phút, thu dịch khuẩn ở 40C, lọc qua màng lọc 0,45 𝜇𝑚

Hoạt hóa trên môi trường SDA, trong 7 – 12 ngày

Chuẩn bị dịch nấm: Điều chỉnh mật độ vi nấm bằng nước muối sinh lý 0,85 % bổ sung Tween 80 Mật độ đạt 106CFU/ mL (OD530nm

= 0,08 – 0,12)

Trải nấm trên mặt thạch môi trường PDA

Đục lỗ thạch đường kính 7 mm bằng dụng cụ vô trùng

Quan sát, xác định đường kính vòng khángThêm vào giếng

thạch (80 – 100 μL)

Ủ 370C/ 18 – 24 giờ