phân lập và khảo sát khả năng phân hủy nhựa polyethylene của hệ vi sinh vật đường ruột sâu sáp achroia grisella

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ∞0∞ -

VƯƠNG GIA THANH

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NHỰA POLYETHYLENE CỦA HỆ VI SINH VẬT

ĐƯỜNG RUỘT SÂU SÁP Achroia grisella

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - ∞0∞ -

VƯƠNG GIA THANH

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NHỰA POLYETHYLENE CỦA HỆ VI SINH VẬT

ĐƯỜNG RUỘT SÂU SÁP Achroia grisella

Mã số sinh viên: 1853010157 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS NGUYỄN NGỌC BẢO CHÂU

TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

Trang 3

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Độc lập – Tự do – Hạnh phúc KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Vương Gia Thanh

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học – Khoa Công nghệ sinh học Mã sinh viên: 1853010157

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Ký tên

Vương Gia Thanh

Trang 4

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Ngọc Bảo Châu

Học viên thực hiện:Vương Gia Thanh Lớp: DH18NN01

Ngày sinh: 18/10/2000 Nơi sinh: Tp.Hồ Chí Minh Tên đề tài: Phân lập và khảo sát khả năng phân hủy nhựa polyethylene của

hệ vi sinh vật đường ruột sâu sáp Achroia grisella (Pyralidae, Lepidotera)

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép sinh viên được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng:

Sinh viên đã hoàn thành các mục tiêu của nghiên cứu và chỉnh sửa theo góp ý của phản biện Giảng viên hướng dẫn đồng ý cho sinh viên được bảo vệ khoá luận trước Hội đồng

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 9 năm 2022

Người nhận xét

TS Nguyễn Ngọc Bảo Châu

Trang 5

VƯƠNG GIA THANH 3

Tiếp theo, em xin cảm ơn gia đình bạn bè đã luôn ủng hộ và động viên em để em có thể vượt qua những giai đoạn khó khăn

Ngoài ra, em xin chân thành cảm ơn các anh chị và các bạn ở phòng thí nghiệm Động Vật học đã luôn góp ý và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện thực tập thực tập tốt nghiệp tạo điều kiện thuận lợi cho em được tìm hiểu thực tiễn trong suốt quá trình thực tập Cùng với đó là tập thể giáo viên và cán bộ nhân viên nhà trường lời chúc sức khỏe, thành công trong cuộc sống

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2022

Vương Gia Thanh

Trang 6

VƯƠNG GIA THANH 4

MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG 7

1 TỔNG QUAN VỀ NHỰA POLYETHYLENE 12

1.1 Giới thiệu về polyethylene 12

1.2 Hiện trạng rác thải nhựa ở nước ta 12

2 TỔNG QUAN VỀ BƯỚM SÁP Achroia grisella 13

2.1 Giới thiệu về bướm sáp 13

2.2 Giới thiệu về bướm sáp Achroia grisella 14

2.3 Sâu sáp và hệ vi sinh vật nội sinh đường ruột của sâu sáp Achroia grisella trong xử lý rác thải nhựa 14

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 17

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 17

1 THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG 17

1.1 Thiết bị và dụng cụ 17

1.2 Hóa chất và môi trường 17

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

Trang 7

VƯƠNG GIA THANH 5

2.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng ăn nhựa polyethylene và polypropylene của sâu sáp ở các tuổi trong giai đoạn ấu trùng 18

2.2 Thí nghiệm 2: Phân lập hệ vi vật đường ruột sâu sáp Achroia grisella 19

2.3 Thí nghiệm 3: Sàng lọc các chủng vi khuẩn từ đường ruột sâu sáp có khả năng phân hủy nhựa polyethylene 20

2.4 Thí nghiệm 4: Định danh các chủng vi sinh vật đường ruột có khả năng phân hủy nhưa bằng kĩ thuật sinh học phân tử 21

2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của chủng vi khuẩn đã phân lập 23

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

1 THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĂN NHỰA POLYETHYLENE VÀ POLYPROPYLENE CỦA SÂU SÁP Ở CÁC TUỔI TRONG GIAI ĐOẠN ẤU TRÙNG Achroia grisella 26

1.1 Hiệu suât ăn nhựa của ấu trùng sâu sáp 26

Trang 8

VƯƠNG GIA THANH 6

5 THÍ NGHIỆM 5: KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA CHỦNG VI KHUẨN ĐÃ PHÂN LẬP 39

5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 39

Trang 9

VƯƠNG GIA THANH 7

DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Bảng nghiệm thức thí nghiệm 18

Bảng 2: Bố trí thí nghiệm 21

Bảng 3: Hiệu suất ăn nhựa polypropylene của ấu trùng sâu sáp sau 5, 10, 15, 20 ngày 26

Bảng 4: Hiệu suất ăn nhựa polyethylene của ấu trùng sâu sáp sau 5,10,15,20 ngày 28

Bảng 5: So sánh hiệu suất ăn nhựa của sâu sáp với 2 nguồn thức ăn 29

Bảng 6: Tỉ lệ sống sót của sâu sáp sau 5,10,15,20 ngày ăn nhựa polyethylene 30

Bảng 7: Tỉ lệ sống sót của sâu sáp sau 5,10,15,20 ngày ăn nhựa polypropylene 30

Bảng 8 So sánh tỉ lệ sống chết của sâu sáp theo kiểu t-test 31

Bảng 9: Các chủng vi khuẩn phân lập từ đường ruột của sâu sáp Achroia grisella 34

Bảng 10: Hiêu suất phân hủy nhựa polyethylene của các chủng vi khuẩn từ đường ruột sâu sáp 35

Bảng 11: Kết qua li trích DNA vi khuẩn 37

Bảng 12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến các chủng vi khuẩn vào ngày 1 (CFU/ml) 39

Bảng 15: Ảnh hưởng của pH đến các chủng vi khuẩn vào ngày 1 (CFU/ml) 40

Trang 10

VƯƠNG GIA THANH 8

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1 Bướm sáp Achroia grisella ( Nguồn internet ) 14

Hình 2: Bố trí thí nghiệm 18

Hình 3: Bố trí thí nghiệm 21

Hình 4: Đường ruột sâu sáp Achroia grisella 33

Hình 5: A) Tấm nilon chìm xuống sau 2 tháng nuôi lỏng lắc ; B) Tấm nilon vẫn nổi sau 2 tháng nuôi lỏng lắc 35

Hình 6: Bảng điện di DNA vi khuẩn 37

Hình 7: Cây phả hệ của chủng T1 xây dựng theo phương pháp Maximum Likelihood 38

Trang 11

VƯƠNG GIA THANH 9

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhựa Polyme có các ưu điểm về độ dẻo, độ bền và giá thành rẻ nên chúng được sử dụng rộng rãi cuộc sống của chúng ta Tuy nhiên, trong điều kiện bình thường trong tự nhiên, chai nhựa (thường được làm bằng polyethylene, còn được gọi là PET, hoặc polyethylene terephthalate) sẽ bắt đầu phân hủy chỉ sau 500 - 700 năm và thậm chí sau đó, quá trình này sẽ rất chậm còn túi nhựa sẽ bắt đầu quá trình này chỉ sau một nghìn năm nữa Đây cũng là lí do dẫn đến hiện trạng ô nhiễm rác thải nhựa trên thế giới Ô nhiễm nhựa đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe động vật và con người Nhựa có thể tích tụ trong dạ dày khi động vật ăn phải Hơn nữa, sự tích tụ nhựa trong chuỗi thức ăn cuối cùng có thể gây ra những ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người

Hiện nay, trên thế giới cứ mỗi phút có một triệu chai nhựa được bán ra, mỗi năm có 5000 tỷ túi nilon được tiêu thụ Ở Việt Nam, thống kê bình quân, mỗi hộ gia đình sử dụng khoảng 1 kg túi nilon/tháng Mỗi năm, có khoảng 80 triệu tấn polyethylene được sản xuất trên toàn thế giới Khi trở thành rác thải thì một chiếc túi nhựa có lượng polyethylene thấp cũng phải mất 100 năm mới có thể phân hủy hoàn toàn và túi nhựa có lượng polyethylene cao thì phải mất đến 400 năm Hiện nay các biện pháp xử lí rác thải nhựa chủ yếu là đốt, chôn lấp, bên cạnh đó việc tái chế chất thải nhựa rất tốn kém và có thể gây ra sự ô nhiễm thứ cấp

Bướm sáp (Lesser wax moth) có tên khoa học là Achroia grisella, thuộc giới

Animalia, ngành Athropoda, lớp Insecta, bộ Lepidotera, họ Pyralidae, chi Achroia,

loài A grisella Ấu trùng bướm sáp được coi là loài có ích cho việc phá hủy sáp tổ

ong còn dư lại, nơi chứa nhiều mầm bệnh và thuốc trừ sâu Chúng phân bố khắp nơi trên thế giới, đặc biệt những nơi có tổ ong, phát triển mạnh hơn ở các vùng cận nhiệt và nhiệt đới Thức ăn của bướm sáp là sáp ong, sáp ong là một dạng polymer, chất dẻo tự nhiên và có cấu trúc hóa học tương tự polyethylene Chúng cũng được ghi nhận là rất thích ăn túi nhựa, khả năng tiêu hóa nhựa của sâu bướm có thể là do sự tương đồng về cấu trúc giữa nhựa và loại sáp ong trong chế độ ăn uống thông thường

Trang 12

VƯƠNG GIA THANH 10 của chúng Đây là lý do để chúng tôi quyết định thực hiện đề tài nghiên cứu: “PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NHỰA POLYETHYLENE CỦA

HỆ VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT SÂU SÁP Achroia grisella”

MỤC TIÊU

- Tìm ra sự khác biệt giưa khả năng ăn nhựa của sâu sáp giữa 2 nguồn thức ăn polyethylene và polypropylene.

- Phân lập các chủng vi sinh vật từ đường ruột sâu sáp Achroia grisella.

- Khảo sát khả năng phân hủy nhựa polyethylene của các chủng vi khuẩn từ đường ruột sâu sáp.

NỘI DUNG THỰC HIỆN

- Khảo sát khả năng ăn nhựa polyethylene và polypropylen của sâu sáp ở các tuổi trong giai đoạn ấu trùng.

- Phân lập hệ vi sinh vật từ đường ruột sâu sáp Achroia grisella và xác định các

chủng vi khuẩn bằng kĩ thuật sinh học phân tử.

- Sàng lọc các chủng vi sinh vật từ đường ruột sâu sáp có khả năng phân hủy nhựa polyethylene.

- Định danh chủng vi sinh vật đường ruột sâu sáp bằng kĩ thuật sinh học phân tử - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của chủng vi khuẩn đã phân

lập

Trang 13

VƯƠNG GIA THANH 11

PHẦN I: TỔNG QUAN

Trang 14

1 TỔNG QUAN VỀ NHỰA POLYETHYLENE

1.1 Giới thiệu về polyethylene

Polyethylen được tổng hợp lần đầu tiên bởi nhà hoá học người Đức Hans von Pechman vào năm 1898, một cách tình cờ trong quá trình ông nghiên cứu diazomethane Khi các đồng nghiệp của ông khảo sát hợp chất màu trắng, nhờn như mỡ sáp mà ông đã tổng hợp, họ nhận thấy nó chứa mạch dài -CH2- và đặt tên nó là polymethylene

Polyethylene hoặc polythene (PE), được coi là loại nhựa phổ biến nhất trên thê giới Tính đến năm 2017, hơn 100 triệu tấn nhựa PE được sản xuất hàng năm, chiếm 34% tổng thị trường nhựa (Geyer và cộng sự, 2017) Nhiều loại PE được biết đến, với hầu hết có công thức hóa học (C2H4)n PE thường là hỗn hợp các polyme với nhiều nhóm C2H4 liên kết với nhau bằng liên kết hydro

Polyethylene là một polyme tổng hợp có khối lượng phân tử cao chứa cấu trúc của hydrocacbon no mạch thẳng

Quá trình trùng hợp ethylene dẫn đến các chuỗi hydrocacbon dài mạch thẳng phân nhánh theo nhiều hướng khác nhau Mức độ phân nhánh này quyết định loại polyethylene Sử dụng các loại polyethylene khác nhau có một số ưu điểm, chẳng hạn như chúng có điểm nóng chảy và đông đặc rất cao Chúng được phân loại là polyethylene mật độ cao (HDPE), mật độ thấp (LDPE), mật độ thấp mạch thẳng (LLDPE)

1.2 Hiện trạng rác thải nhựa ở nước ta

Những con số thống kê lượng sử dụng túi nilon, chai nhựa cho thấy tình hình rác thải nhựa ở Việt Nam thật đáng lo ngại

Theo Bộ Tài nguyên và Môi trường, mỗi tháng, mỗi gia đình sử dụng đến 1kg túi nilon Ở những thành phố lớn như Hà Nội và Hồ Chí Minh, số lượng rác thải nhựa mỗi ngày thải ra môi trường lên tới 80 tấn Còn theo thống kê của Hiệp hội nhựa Việt Nam thì trong khoảng thời gian 1990 – 2015 số lượng tiêu thụ nhựa ở Việt Nam đã tăng lên chóng mặt, từ 3,8 kg/người/năm lên đến 41 kg/ người/ năm

Trang 15

VƯƠNG GIA THANH 13 Tuy nhiên việc thu hồi và xử lý rác thải tại Việt Nam còn rất hạn chế Lượng chất thải nhựa và túi nilon ở Việt Nam, chiếm khoảng 8-12% chất thải rắn sinh hoạt Nhưng 10% số lượng chất thải nhựa và túi nilon không được tái sử dụng mà thải bỏ hoàn toàn ra ngoài môi trường Lượng chất thải nhựa và túi nilon thải bỏ ở Việt Nam xấp xỉ khoảng 2,5 triệu tấn/năm Đây là một “gánh nặng” cho môi trường, thậm chí có thể dẫn đến thảm họa “ô nhiễm trắng” mà các chuyên gia đã gọi

Rác thải nhựa có thời gian phân hủy rất dài lên đến cả 100 năm thậm chí 1000 năm, chúng sẽ bị phân rã thành các mảnh nhựa siêu nhỏ, những hạt vi nhựa (microplastic) này đi vào nguồn nước, đất, không khí, thức ăn… và khi con người tiếp xúc, ăn phải những mảnh vi nhựa này thì sẽ ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe Đây cũng là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh nguy hiểm như bệnh về hô hấp, bệnh về thần kinh,…

Ngoài ra, theo các nhà khoa học việc xử lý rác thải nhựa bằng cách đốt cũng gây ra nhiều nguy hiểm cho sức khoẻ cả cộng đồng vì khi đốt rác thải nhựa sẽ tạo ra khí dioxin và furan… gây khó thở, rối loạn tiêu hoá, làm tăng khả năng ung thư.

2 TỔNG QUAN VỀ BƯỚM SÁP Achroia grisella

2.1 Giới thiệu về bướm sáp

loài A grisella

Loài được mô tả đầu tiên bởi Johan Christian Fabricius vào năm 1794 Con trưởng thành dài khoảng 0,5 inch (13 mm) và có đầu màu vàng riêng biệt với thân màu xám bạc hoặc màu be Trong tự nhiên, ấu trùng của loài bướm này sống như những ký sinh trùng làm tổ trong các đàn ong và ăn kén, phấn hoa, sáp ong, do đó có tên gọi là sâu sáp

Bướm sáp phân bố khắp nơi trên thế giới, đặc biệt những nơi có tổ ong, phát triển mạnh hơn ở các vùng cận nhiệt và nhiệt đới,chúng phân bố ở hầu hết Châu Phi (bao gồm Madagascar, Úc , Châu Âu và Bắc Mỹ Ấu trùng sâu sáp được sử dụng như là nguồn thức ăn lí tưởng cho nhiều loài động vật và thực vật ăn côn trùng Ngoài ra,

Trang 16

VƯƠNG GIA THANH 14 chúng cũng được sử dụng để làm thức ăn cho người, cũng như thức ăn sống cho vật nuôi và một số loài chim cảnh do hàm lượng chất béo cao, dễ sinh sản và khả năng tồn tại trong nhiều tuần ở nhiệt độ thấp

2.2 Giới thiệu về bướm sáp Achroia grisella

Hình 1 Bướm sáp Achroia grisella ( Nguồn internet )

loài A.grisella Vòng đời của bướm sáp gồm 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, nhộng, bướm trưởng thành

Thức ăn của bướm sáp là sáp ong, sáp ong là một dạng polymer, chất dẻo tự nhiên và có cấu trúc hóa học tương tự polyethylene

2.3 Sâu sáp và hệ vi sinh vật nội sinh đường ruột của sâu sáp Achroia grisella

trong xử lý rác thải nhựa.

Đến nay, các nhà nghiên cứu vẫn đang cố gắng phát hiện các vi sinh vật phân giải PE thông qua các thử nghiệm liên quan đến đất bị ô nhiễm chất thải nhựa, bãi chôn lấp, phân trộn và biển sự sống và đã phân lập được một số chủng vi khuẩn Một số chủng vi khuẩn này đã cho thấy khả năng sử dụng PE làm nguồn cacbon dựa trên đặc điểm của sự hình thành màng sinh học trên màng PE, giảm trọng lượng vật liệu PE, sự suy giảm bề mặt và những thay đổi trong tính chất cơ và nhiệt của PE Tuy nhiên, các báo cáo đầy hứa hẹn này về sự phân hủy của PE dựa trên việc thay đổi khối lượng vẫn chưa được xác nhận do không cung cấp được bằng chứng hỗ trợ chứng minh cho việc này, chẳng hạn như những thay đổi về tính kỵ nước ở bề mặt

Trang 17

VƯƠNG GIA THANH 15 của tấm nilon, sự hình thành của các nhóm cacbonyl bị oxy hóa, sự đứt gãy của các chuỗi phân tử dài (Yang Jung và cộng sự, 2014)

Lịch sử nghiên cứu:

1 Kể từ đầu những năm 1970, các nhà nghiên cứu đã nghiên cứu sự phân hủy sinh học của Polyethylene và tìm thấy một số chủng phân hủy Polyethylene

nhất định, bao gồm Bacillus, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus,

Streptomyces, Brevibacterium, Nocardia, Moraxella, Penicillium và Aspergillus

từ đất, biển và bùn thải trong tự nhiên Tuy nhiên, tính kỵ nước mạnh, năng lượng liên kết hóa học cao và trọng lượng phân tử cao của PE cản trở sự phân hủy hiệu quả của nó đối với hầu hết các chủng, đặc biệt là trong thời gian ngắn

Người ta đã chỉ ra rằng sự phân huỷ PE do nấm Penicillium simplicissimum và

Nocardia asteroides có thể mất vài tháng hoặc thậm chí lâu hơn

2 Yang Jun và cộng sự (2014) đã báo cáo rằng PE có thể bị phân hủy đáng kể bởi

vi sinh vật của sâu sáp Ấn Độ, hai chủng vi khuẩn nội sinh Enterobacter

asburiae YT1 và Bacillus sp YP1, đã được phân lập từ ruột sâu sáp Sau thời

gian ủ 60 ngày, khoảng 6% và 11% màng PE bị phân huỷ bởi YT1 và YP1 Những kết quả này chỉ ra rằng côn trùng có thể là một nguồn đầy hứa hẹn để thu được các vi sinh vật phân giải PE Tương tự, Paolo Bombelli và cộng sự nhận thấy rằng túi nhựa PE bị mất khối lượng 92 mg sau khi tiếp xúc với khoảng 100 con sâu sáp, và ethylene glycol được tạo ra trong 12 giờ (Liu Ren và cộng sự, 2019)

3 Liu Ren và cộng sự (2019) đã phân lập được chủng vi khuẩn Enterobacter sp

D1 từ ruột sâu sáp Galleria mellonella và chủng vi khuẩn này có khả năng phân

hủy màng polyethylene

4 Adriana Chalup và cộng sự ( 2018) đã nghiên cứu rằng loài bướm sáp Achroia

grisella phá hại tổ ong có khả năng tiêu thụ túi silo (túi silo có thành phần gồm

ba lớp polyethylene và một lớp chống tia cực tím dùng để quản lí tổ ong)

Trang 18

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Trang 19

ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2021 đến tháng 9/2022 tại phòng thí nghiệm trường đại học Mở TP Hồ Chí Minh cở sở 3 Bình Dương

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Túi nilon polyethylene, mút xốp polypropylene

- Sáp ong được thu thập ở thị xã Tân Uyên, tỉnh Bình Dương

- Ấu trùng bướm sáp Achroia grisella

1 THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG 1.1 Thiết bị và dụng cụ

- Pipet (thủy tinh và micropipet) - Đèn cồn

- Máy vortex - Thước đo

1.2 Hóa chất và môi trường

Môi trường:

- NA (Nutrient Agar) Hóa chất:

- Thuốc nhuộm: bộ nhuộm Gram

Trang 20

VƯƠNG GIA THANH 18 - Hóa chất: Ethanol 700, Ethanol 960, SDS (Sodium dodecyl sunfate), NaCl, D-

glucose

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng ăn nhựa polyethylene và polypropylene của sâu sáp ở các tuổi trong giai đoạn ấu trùng

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức ứng với 5 tuổi của giai đoạn ấu trùng bướm sáp và nghiệm thức đối chứng với 3 lần lặp lại

Trang 21

VƯƠNG GIA THANH 19 C: Nghiệm thức gồm 30 ấu trùng sâu sáp tuổi 3 và 1g polyethylene/polypropylene D: Nghiệm thức gồm 30 ấu trùng sâu sáp tuổi 4 và 1g polyethylene/polypropylene E: Nghiệm thức gồm 30 ấu trùng sâu sáp tuổi 5 và 1g polyethylene/polypropylene - Cân lại khối lượng nilon polyethylene, polypropylene sau 5, 10, 15, 20 ngày kể

từ ngày thả sâu

• Chỉ tiêu theo dõi và phương pháp tính chỉ tiêu:

- Tỉ lệ sống sót của sâu sáp sau 5, 10, 15, 20 ngày ăn nilon: là tỉ lệ % giữa số sâu sống và tổng số sâu sau 5, 10, 15, 20 ngày

- Phần trăm nilon tổn thất được tính bằng cách sử dụng công thức sau (Das và Kumar, 2015):

H (%) = 𝑇−𝑆

Trong đó:

H: Hiệu xuất phân hủy nhựa

T: Khối lượng nilon đầu ở các nghiệm thức S: Khối lượng nilon còn lại sau 5, 10, 15, 20 ngày

2.2 Thí nghiệm 2: Phân lập hệ vi vật đường ruột sâu sáp Achroia grisella

- Khử trùng mẫu sâu: ngâm mẫu trong cồn 750 trong 1 phút, rửa mẫu 2 lần với nước muối 0,85% NaCl, cắt rút đường ruột của sâu cho vào ống falcon chứa 40 ml nước muối và vortex trong 5 phút

- Hút 200 µl dịch cấy trang vào môi trường SNB (Solid Nutrient Broth) nuôi cấy trong 24 giờ

- Làm thuần vi khuẩn nội sinh bằng phương pháp cấy ria trên môi trường SNB (Solid Nutrient Broth)

- Quan sát đặc điểm khuẩn lạc: màu sắc, hình dáng, …

Nhuộm Gram:

Trang 22

VƯƠNG GIA THANH 20 - Nguyên tắc: Sự khác nhau giữa vách tế bào Gram (+) và Gram (-) làm cho

khả năng bắt màu màng tế bào với thuốc nhuộm khác nhau giữa hai nhóm vi khuẩn Dựa vào đặc điểm này người ta phân thành hai nhóm vi khuẩn

safranin O và để yên trong 1 phút Rửa với nước

• Thấm khô phiến kính với giấy thấm Khi phiến kính khô hoàn toàn, đặt lamen lên và quan sát dưới kính hiển vi với vật kính x100 (Trần Linh Thước, 2007)

2.3 Thí nghiệm 3: Sàng lọc các chủng vi khuẩn từ đường ruột sâu sáp có khả năng phân hủy nhựa polyethylene

- Cấy các chủng vi khuẩn vừa phân lập được vào bình serum chứa 40 ml môi trường LCFBM (Liquid carbon – free basal medium) chứa tấm nilon polyethylene kích thước 3×3 cm Các bình serum không được cấy vi khuẩn sẽ là nghiệm thức đối chứng

- Nuôi lỏng lắc 220 vòng/ phút và ủ ở nhiệt độ 37oC trong 60 ngày

- Sau 60 ngày, các tấm nilon sẽ được thu thập và được rửa bằng SDS (Sodium dodecyl sulfate) 2% và rửa bằng nước cất 3 lần để loại bỏ màng biofilm vi khuẩn bám trên bề mặt tấm nilon, sau đó cân bằng phân tích để xác định khối lượng polyethylene hao hụt Phần trăm nilon tổn thất được tính bằng cách sử dụng công thức sau (Das và Kumar, 2015):

Trang 23

VƯƠNG GIA THANH 21 Trong đó:

H: Hiệu xuất phân hủy nhựa (%)

T: Khối lượng nilon đầu ở các nghiệm thức

S: Khối lượng nilon còn lại sau 5, 10, 15, 20 ngày

- Các vi khuẩn phát triển trong môi trường LCFBM chứa tấm polyethylene, được coi là khuẩn lạc sàng lọc sơ cấp để tìm vi khuẩn phân hủy PE

2.4 Thí nghiệm 4: Định danh các chủng vi sinh vật đường ruột có khả năng phân hủy nhưa bằng kĩ thuật sinh học phân tử

❖ Li trích DNA vi khuẩn ( theo Võ Thị Xuân Hương và cộng sự, 2018) DNA vi khuẩn được li trích bằng phương pháp đun sôi:

- Mẫu vi khuẩn được nuôi cấy tăng sinh ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ Sau đó hút 1ml tăng sinh vi khuẩn cho vào ống tube eppendorf 1,5ml ly tâm 8000 vòng /phút trong 3 phút, loại bỏ dịch nuôi cấy thu kết tủa

- Sau đó thêm 300ul TE buffer, votex để trộn đều tế bào vi khuẩn Cho vào nồi nước đang sôi ở 100°C trong vòng 15 phút Sau đó sốc nhiệt ở – 20°C trong 5 phút và ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút

- Tiếp tục hút 200ul dung dịch nổi phía trên cho vào ống tube 1,5ml mới, cho thêm 20ul CH3COONa, 600ul Etanol 70% ủ trong tù - 20°C trong 1 đến 2

Bảng 2: Bố trí thí nghiệm Hình 3: Bố trí thí nghiệm

Trang 24

VƯƠNG GIA THANH 22 giờ Ly tâm 13000 vòng/phút, bỏ dịch nổi để khô trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

- Cuối cùng cho thêm 50ul TE buffer hoặc nước cất khử ion Bảo quản mẫu DNA ở - 20°C

- Đo OD để kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ của DNA ❖ Phản ứng PCR

- Phản ứng tiến hành với cặp mỗi không chuyên biệt nhằm khuếch đại vùng gen 16S rRNA

16S-rRNA-F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'); 16S-rRNA-R(5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')

- Thực hiện phản ứng PCR với tổng thể tích 25ul: 1,25ul primer-F; 1,25ul primer-R; lui mẫu DNA: 12,5ul GoTaq polymerase vào ống tube PCR Bổ sung thêm 9ụl nước cất khử ion Tất cả đều được trộn đều trước khi thực hiện phản ứng PCR

- Quy trình chạy phản ứng PCR theo chương trình luân nhiệt như sau: 95°C trong 4 phút, sau đó lặp lại 30 chu kỳ với các bước như sau: Biến tỉnh 95°C trong 30 giây, bắt cặp mồi ở 53°C trong 30 giây, tổng hợp DNA ở 72°C trong 1 phút Cuối cùng phản ứng duy trì ở 72°C trong 5 phút Bảo quản ở 4°C - Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%, trong dung dịch đệm TBE

buffer 0,5X ở 100V, 90mA trong 20 phút Trộn đều mẫu và loader với tỉ lệ: 0,5ul loadingdye buffer 6X và 5ul sản phẩm PCR vào trong các giếng của gel ( Võ Thị Xuân Hương và cộng sự, 2018)

❖ Giải trình tự và xây dựng cây phát sinh loài

- Kết quả PCR được gửi đi giải trình tự ở công ty 1st Base Malaysia

- Định danh bằng phương pháp: BLAST, dựng cây phát sinh loài bằng phương pháp Maximum Likelihood

Trang 25

2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của chủng vi khuẩn đã phân lập

Tất cả số liệu thu được trong đề tài được phân tích thống kê ANOVA (Analysis of Variance) dưới bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên CRD (Completely Randomized Design) Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần và thống kê bằng phần mềm Statgraphic version 3.0

2.5.1 Nhiệt độ

Tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn trong môi trường Nutrient Broth

trong 24h sau đó cấy trang trên môi trường SNB (Solid Nutrient Broth) Ủ đĩa

petri ở nhiệt độ 20o, 30o và nhiệt độ phòng và tính toán mật độ vi khuẩn dựa theo công thức :

𝑉(𝑛1+0,1𝑛2)𝑑Trong đó :

A : số tế bào vi khuẩn trong 1ml mẫu

N : tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn Ni : số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V : thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa Fi : độ pha loãng tương ứng

2.5.2 pH

Tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn trong môi trường Nutrient Broth

trong 24h sau đó cấy trang trên môi trường SNB (Solid Nutrient Broth) pH môi

trường 6,0; 7,0; 8,0 và đo mật độ vi khuẩn bằng công thức như trên và tính toán mật độ vi khuẩn dựa theo công thức :

Trang 26

𝑉(𝑛1+0,1𝑛2)𝑑Trong đó :

- N là số vi sinh vật trong một đơn vị kiểm tra (được tính bằng CFU/ ml) - C là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa petri được giữ lại; - n1 là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất;

- n2 là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai;

- d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất - V là thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa

Trang 27

VƯƠNG GIA THANH 25 -

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Trang 28

1 THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĂN NHỰA

POLYETHYLENE VÀ POLYPROPYLENE CỦA SÂU SÁP Ở CÁC TUỔI

TRONG GIAI ĐOẠN ẤU TRÙNG Achroia grisella

1.1 Hiệu suât ăn nhựa của ấu trùng sâu sáp

Bảng 3: Hiệu suất ăn nhựa polypropylene của ấu trùng sâu sáp sau 5, 10, 15, 20 ngày

Nghiệm thức

Hiệu suất ăn nhựa polypropylene (%)

- Hiệu suất ăn nilon polypropylene của sâu sáp sau 5 ngày:

• Giá trị phần hiệu suất ăn nilon polypropylene của sâu sáp đã được chuyển đổi √𝑋 + 0,5 trước khi xử lí thống kê

• Có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức các tuổi sâu khác nhau (P = 0,000) qua thống kê Trong đó hiệu suất ăn polypropylen của nghiệm thức sâu tuổi 3 (T3) cao nhất (14,33 ± 0.05) và và tương đương với nghiệm thức sâu tuổi 2,3,4; hiệu suất ăn nilon của nghiệm thức sâu tuổi 5 (T5) là thấp nhất (4 ± 0.01) so với các nghiệm thức khác sau 5 ngày ăn nilon polyethylene

• Có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức các tuổi sâu khác nhau (P = 0,0001) qua thống kê Trong đó hiệu suất ăn polypropylen của nghiệm thức sâu tuổi 3 (T3) cao nhất (21,67 ± 0.07%); hiệu suất ăn nilon của nghiệm thức sâu tuổi 5 (T5)

Trang 29

VƯƠNG GIA THANH 27 là thấp nhất (5 ± 0.01%) so với các nghiệm thức khác sau 10 ngày ăn nilon polypropylene

- Hiệu suất ăn nilon polypropylen của sâu sáp sau 15 ngày:

Có sự khác biệt rất có ý nghĩa giữa các nghiệm thức các tuổi sâu khác nhau (P = 0,000) qua thống kê Trong đó hiệu suất ăn polypropylen của nghiệm thức sâu tuổi 3 (T3) cao nhất (25,33 ± 0.05%); hiệu suất ăn nilon của nghiệm thức sâu tuổi 1 (T1) là thấp nhất (6,33 ± 0.01%) so với các nghiệm thức khác sau 15 ngày ăn nilon polypropylene

Có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức các tuổi sâu khác nhau (P = 0,000) qua thống kê Trong đó hiệu suất ăn polyethylen của nghiệm thức sâu tuổi 3 (T3) cao nhất (29,33 ± 0.07%); hiệu suất ăn nilon của nghiệm thức sâu tuổi 5 (T5) là thấp nhất (7,67 ± 0.01%) Giá trị hiệu suất ăn nilon của sâu tuổi 1, 2 sau 20 ngày là thấp nhưng có tăng lên so với sau 5, 10, 15 ngày

Trang 30

VƯƠNG GIA THANH 28 Bảng 4: Hiệu suất ăn nhựa polyethylene của ấu trùng sâu sáp sau 5,10,15,20 ngày

- Hiệu suất ăn nilon polyethylen của sâu sáp sau 5 ngày:

• Giá trị phần hiệu suất ăn nilon polyethylene của sâu sáp đã được chuyển đổi √𝑋 + 0,5 trước khi xử lí thống kê

• Có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức các tuổi sâu khác nhau (P = 0,0000) qua thống kê Trong đó hiệu suất ăn polyethylen của nghiệm thức sâu tuổi 3 (T3) cao nhất (17,33 ± 0.02%) ; hiệu suất ăn nilon của nghiệm thức sâu tuổi 1 (T1) là thấp nhất (5 ± 0.01%) so với các nghiệm thức khác sau 5 ngày ăn nilon polyethylene

• Có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức các tuổi sâu khác nhau (P = 0,0001) qua thống kê

• Trong đó hiệu suất ăn polyethylen của nghiệm thức sâu tuổi 3 (T3) cao nhất (26 ± 0.01%); hiệu suất ăn nilon của nghiệm thức sâu tuổi 5 (T5) là thấp nhất

(8,33 ± 0.02%) so với các nghiệm thức khác sau 10 ngày ăn nilon polyethylene - Hiệu suất ăn nilon polyethylen của sâu sáp sau 15 ngày:

Trang 31

VƯƠNG GIA THANH 29 • Trong đó hiệu suất ăn polyethylen của nghiệm thức sâu tuổi 3 (T3) cao nhất (34 ± 0.02%); hiệu suất ăn nilon của nghiệm thức sâu tuổi 5 (T5) là thấp nhất (8 %) so với các nghiệm thức khác sau 15 ngày ăn nilon polyethylene

• Trong đó hiệu suất ăn polyethylen của nghiệm thức sâu tuổi 3 (T3) cao nhất (38,17 ± 0.02%); hiệu suất ăn nilon của nghiệm thức sâu tuổi 5 (T5) là thấp nhất (8,33 ± 0.01%) Giá trị hiệu suất ăn nilon của sâu tuổi 1,2 sau 20 ngày là thấp nhưng có tăng lên so với sau 5, 10, 15 ngày

❖ So sánh hiệu suất ăn nhựa Polypropylene và polyethylene sau 5,10,15,20 ngày:

Bảng 5: So sánh hiệu suất ăn nhựa của sâu sáp với 2 nguồn thức ăn

- Hiệu suất ăn nhựa polypropylene và polyethylene của ấu trùng sâu sáp sau 5 ngày không có sự khác biệt qua thống kê( T tính= 2,01 < T bảng= 2,63) - Hiệu suất ăn nhựa polyethylene cao hơn hiệu suất ăn nhựa polypropylene sau

10 ngày, sau 15, 20 ngày và có sự khác biệt qua thống kê

Trang 32

Trong cùng một cột các giá trị có cùng mẫu tự không khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05 qua phép thử Duncan Số liệu trình bày trong bảng là số TB ± SD

❖ Giá trị phần trăm sống sót của sâu sáp đã được chuyển đổi arcsin trước khi xử lí thống kê

❖ Từ bảng 6: Có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức các tuổi sâu khác nhau (P = 0,000) Trong đó nghiệm thức sâu tuổi 5 (T5) có tỉ lệ sống sót cao nhất (sau 5 ngày: 91,11 ± 1,92%; sau 10 ngày: 73,33 ± 3,33%; sau 15 ngày: 60 ± 3,33%; sau 20 ngày: 52,22 ± 1,92%) và tỉ lệ sống sót của nghiệm thức sâu tuổi 1 (T1) là thấp nhất (sau 5 ngày: 80 ± 3,33 %; sau 10 ngày: 52,22 ± 3,85%; sau 15 ngày: 34,44 ± 1,92%; sau 20 ngày: 2,22 ± 1,92%) so với các nghiệm thức khác sau 5, 10, 15, 20 ngày ăn nilon polyethylene

Trang 33

VƯƠNG GIA THANH 31 Bảng 7: Tỉ lệ sống sót của sâu sáp sau 5,10,15,20 ngày ăn nhựa polypropylene

Trong cùng một cột các giá trị có cùng mẫu tự không khác biệt ở mức ý nghĩa 0,05 qua phép thử Duncan

- Giá trị phần trăm sống sót của sâu sáp đã được chuyển đổi arcsin trước khi xử lí thống kê

- Từ bảng 7: Có sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức các tuổi sâu khác nhau (P = 0,000) Trong đó nghiệm thức sâu tuổi 5 (T5) có tỉ lệ sống sót cao nhất (sau 5 ngày: 81,11± 5,1%; sau 10 ngày: 71,11 ± 6,94%; sau 15 ngày: 54,55 ± 1,92%; sau 20 ngày: 45,56 ± 5,1%) và tỉ lệ sống sót của nghiệm thức sâu tuổi 1 (T1) là thấp nhất (sau 5 ngày: 64,44 ± 6,9%; sau 10 ngày: 45,56 ± 3,85%; sau 15 ngày: 16,67 ± 3,33%; sau 20 ngày: 4,44 ± 3,85%) so với các nghiệm thức khác sau 5, 10, 15, 20 ngày ăn nilon polypropylene

❖ So sánh tỉ lệ sống chết của sâu sáp ăn nhựa polyethylene và polypropylene

Bảng 8 So sánh tỉ lệ sống chết của sâu sáp theo kiểu t-test

Qua thống kê cho thấy tỉ lệ sống sót của sâu sáp ăn nhựa polyethylene và polypropylene có sự khác biệt có ý nghĩa qua thống kê Tỉ lê sống sót của sâu sáp