phân lập và sàng lọc vi khuẩn lactic kháng vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm tại tỉnh trà vinh

" ooOoo4F

PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC VI KHUẤN Lactic

- xQx4F

PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC VI KHUẤN Lactic

" ooOoo4F

PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC VI KHUẤN Lactic

- xQx4F

PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC VI KHUẤN Lactic

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là : Cao Thị Thùy Linh

Ngày sinh: 06/08/1999 Nơi sinh: Gia Lai

Chuyên ngành: Nông nghiệp-Môi trường Mã học viên : 1753010116 Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho

Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Ngọc Bảo Châu

Học viên thực hiện: Cao Thị Thùy Linh Lớp: NN71 Ngày sinh: 06/08/1999 Nơi sinh: Gia Lai

Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC VI KHUẨN Latic KHÁNG Vibrio

parahaemolyticus GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH TRÊN TÔM TẠI TỈNH TRÀ VINH

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép học viên được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng: Giảng viên đồng ý cho sinh viên Cao Thị Thùy Linh bảo vệ khoá luận tốt

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn quý công ty cổ phần Mỹ Lan và Khoa Công Nghệ sinh học trường đại học Mở TP Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho em được thực tập tại công ty Thời gian thực tập tại đây không những cho em thêm kiến thức mà còn là những bài học quý báu về cách làm việc và ứng xử

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh đã cho em những vốn kiến thức quý báu về chuyên ngành và những chia sẻ đầy thú vị về những trải nghiệm cuộc sống cho em rất nhiều hành trang trong bốn năm đại học

Em xin cảm ơn cô TS Nguyễn Ngọc Bảo Châu, giảng viên hướng dẫn em thực hiện đề tài này, là một người tận tình giúp đỡ, cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài Cô cũng chính là người tiếp rất nhiều động lực cho em Em cảm ơn cô đã luôn quan tâm, nhiệt tình giúp đỡ em những lúc khó khăn, em rất cảm mến vì điều này

Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Tú Trinh đã luôn tạo điều kiện giúp em thực hiện đề tài Cảm ơn chị đã giúp đỡ em những lúc khó khăn để em có tinh thần thực hiện đề tài tốt hơn

Em xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng vi sinh và các bạn thực tập cùng em đã luôn ở bên giúp đỡ, ủng hộ tinh thần cho em

Cuối cùng con xin gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, ba mẹ luôn là người bên cạnh con tạo động lực rất lớn cho con phát triển Con cảm ơn ba mẹ đã luôn tạo điều kiện tốt nhất để con được học tập

1.1.1.Tình hình nuôi tôm trên thế giới và tại Việt Nam: 10

1.1.2. Sơ lược về vi khuẩn Vibrio sp gây bênh trên động vật thủy sản 11 1.2 Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 14

1.3 Hội chứng hoại tử gan tụy – cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome – AHPNS 15

1.4 Sơ lược về vi khuẩn lactic 16

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Thời gian và địa điểm Thực hiện 20

2.3.5.Xác định, chọn lọc tính kháng khuẩn: 28

2.3.6.Thử nghiệm các nồng độ muối khác nhau lên mật số của vi khuẩn: 28 2.3.7.Định danh dòng vi khuẩn lactic bằng phương pháp giải trình tự 16s. 28

РHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29

3.1.1.Kết quả phân lập vi khuẩn từ các nguồn khác nhau. 30

3.2 Xác định hoạt tính kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus.của chủng vi khuẩn phân lập được 37

3.3 Thử nghiệm khả năng sinh bacteriocin và hoạt tính kháng Vibrio parahaemolyticus của vi khuẩn lactic 40

3.4 Thử nghiệm các nồng độ muối khác nhau lên mật số của vi khuẩn 40

3.5 Κết quả định danh 3 dòng vi khuẩn có vòng kháng mạnh nhất với vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus 45

3.5.1.Κết quả định danh vi khuẩn lactic CT4 bằng phương pháp giải trình tự 16s……… 45

3.5.2.Κết quả định danh chủng vi khuẩn AO3bằng phương pháp giải trình tự 16s……… 45

3.5.3.Κết quả định danh chủng vi khuẩn CT3 bằng phương pháp giải trình tự 16s……… 46

4.1 Kết luận 52

4.2 Kiến nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 58

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 : Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (Wu et al., 2014) 12

Hình 1.2 : Tôm sú bị nhiễm khuẩn Vibrio spp.: A- ấu trùng tôm bị bệnh đỏ dọc thân; B- Tôm sú bị bệnh đỏ thân; C- Tôm sú bị bệnh đỏ thân (con thứ 3,4); D- Tôm sú bị bệnh đỏ chân; E- đuôi tôm sú bị ăn mòn; F- đuôi tôm sú bị hoại tử; G- đuôi tôm sú bị đỏ; H- đuôi tôm sú bị phồng; I- tôm sú bị bệnh các phần phụ (râu, chân bò, chân bơi, đuôi) ăn mòn cụt dần (Bùi Quang Tề 2006 Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I) 13

Hình 3.1: Κhuẩn lạc với hình dáng tiêu biểu của các chủng vi khuẩn phân lập 33

Hình 3.2 : Vòng kháng khuẩn V paraheamolyticus của các dòng vi khuẩn lactic phân lập được 37

Hình 3.3 : Κết quả khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus của bacteriocin 40

Hình 3.4 : Biểu đồ thể hiện các nồng độ muối và thời gian nuôi khác nhau lên mật số của chủng lactic CT3 42

Hình 3.5 : Κết quả thử nghiệm các nồng độ muối khác nhau lên mật số vi khuẩn lactic chủng AO3 43

Hình 3.6 : Κết quả thủ nghiệm các nồng độ muối khác nhau lên mật số vi khuẩn lactic chủng CT4 44

Hình 3.7 : Κết quả giải trình tự trên NCBI Blast của chủng CT4 45

Hình 3.8 : Κết quả giả trình tự trên NCBI Blast của chủng AO3 45

Hình 3.9 : Κết quả giải trình tự gen 16s trên NCBI của chủng CT3 46

Hình 3.10 : Cây phát sinh chủng loài chủng vi khuẩn CT3, CT4, AO3 phân lập được với các loài trong cùng chi Lactobacillus Spp dựa trên trình tự 16s rRNA với phương pháp Neighbor- Joining với 1000 lần lặp lại Bacillus amyloliquefaciens (KN723307.1) là loài ngoài nhóm 47Hình 3.11 : Cây phát sinh chủng loài chủng vi khuẩn CT3, CT4, AO3 phân lập được với các loài trong cùng chi Lactobacillus Spp dựa trên trình tự 16s rRNA với phương

pháp Maximum Likelihood với 1000 lần lặp lại Bacillus amyloliquefaciens

(KN723307.1)là loài ngoài nhóm 48Hình 3.12 : Cây phát sinh chủng loài chủng vi khuẩn CT3, CT4, AO3 phân lập được với các loài trong cùng chi Lactobacillus Spp dựa trên trình tự 16s rRNA với phương pháp Maximum Parsimony với 1000 lần lặp lại Bacillus amyloliquefaciens

(KN723307.1)là loài ngoài nhóm 49

Bảng 3.2 : Bảng mô tả hình dáng vi thể của các chủng vi khuẩn 34

Bảng 3.3 : Một số đặc điểm sinh lí sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập được 36

Bảng 3.4 : Đường kính vòng kháng khuẩn của 4 chủng Lactobacillus spp 38

Bảng 3.5 : Mật số vi khuẩn latic ở các nồng độ muối và thời gian nuôi khác nhau 41

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Hội chứng hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease- AHPND)

AHPND

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo Hiệp Hội Chế Biến Và Xuất Khẩu Thủy Sản Việt Nam (2019) Việt Nam có hơn 600.000 ha nuôi tôm với sản lượng 3000 tấn mỗi năm Ngành tôm đóng vai trò quan trọng trong xuất khẩu thủy sản Việt Nam ra thế giới Ngành tôm đóng góp 40-45% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản, tương đương 3,5-4 tỷ USD hàng năm Tuy nhiên trong những năm gần đây hiện tượng tôm chết hàng loạt gây không ít thiệt hại cho nền kinh tế nước nhà nói chung và gây thiệt hại lớn cho ngành tôm nói riêng Được biết hiện tượng tôm chết hàng hoạt hay còn gọi là bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancretic Necrosis Disease- AHPND) trên tôm do vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus gây ra Trên thị trường hiện nay chủ yếu sử dụng kháng sinh trộn vào thức ăn nuôi tôm định kì nhưng gần như không có tác dụng với dòng vi khuẩn

Vibrio parahaemolyticus Ngoài ra sử dụng kháng sinh trong thời gian dài để nuôi tôm gây ảnh hưởng đến môi trường sống của tôm, đến sự tăng trưởng và chất lượng của tôm Thậm chí còn có các vấn đề khác như ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng do dư lượng kháng sinh, hóa chất có trong tôm Một trong những cách an toàn và hiệu quả để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn gây hại trên tôm, đặc biệt là bệnh AHPND là sử dụng vi khuẩn đối kháng để làm chế phẩm thức ăn cho tôm

Đã có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước sử dụng vi khuẩn Lactobacilus để đối kháng với Vibrio spp cho thấy tính đối kháng cao (Chiu et al., 2007) Nghiên cứu

trong nước điển hình như “Рhân lập và kiểm tra khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của

Lactococus garvieae từ hệ tiêu hóa tôm” của Lê Mỹ Tiểu Ngọc và cộng sự (2019) cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất đạt 460AU/ml Đây là tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo để phát triển và sử dụng Lactobacillus spp trong nuôi trồng thủy sản Sử dụng Lactobacillus trong nuôi tôm còn giúp đường ruột của tôm khỏe hơn Các chế phẩm vi sinh được sử dụng trong nước đa số là hàng ngoại nhập giá thành chưa hợp lí và chất lượng chưa được đảm bảo Việc nghiên cứu “Phân lập và sàng lọc vi khuẩn

Hepatopancreatic Necrosis Disease- AHPND) trên tôm tại tỉnh Trà Vinh” là một

vấn đề cần thiết trong hiện tại

Mục tiêu tổng quát của đề tài là phân lập và tuyển chọn những dòng vi khuẩn

lactic có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus

Với mục tiêu trên đề tài được thực hiện với những nội dung như sau: 1 Рhân lập vi khuẩn lactic từ nước ao nuôi tôm, ruột tôm, ruột cá 2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn lactic

3 Thử nghiệm khả năng chịu mặn ở khoảng mặn của môi trường nuôi tôm

PHẦN I: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về ngành tôm

1.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới và tại Việt Nam:

Hiện nay trên thế giới có khoảng 50 nước nuôi tôm (VASEP, 2016) trong đó có các vùng nuôi trọng điểm như Đông Nam Á, Trung Quốc, Ấn Độ, Mỹ và Trung Đông Có rất nhiều mô hình nuôi tôm trên thế giới như tôm thẻ, tôm hùm, tôm sú, nhưng loại tôm được phát triển nhiều nhất là tôm Thẻ Chân Trắng (Litopenaeus vanamei) kế

đến là tôm sú (Penaeus monodon) Theo thống kê của FAO (2011) trong năm 2010

tổng sản lượng thủy sản thế giới đạt đến 148,5 triệu tấn Sản lượng khai thác và nuôi trồng thủy sản toàn cầu có thể đạt kỷ lục mới 160 triệu tấn trong năm 2013, so với 157 triệu tấn của năm 2012 trong khi xuất khẩu thủy sản sẽ đạt 136 tỉ USD, nuôi trồng chiếm 59,9 triệu tấn, ước tính tăng khoảng 25 triệu tấn so với năm 2001 Trong đó, sản lượng cá nước ngọt chiếm 56,4 % (33,7 triệu tấn), nhuyễn thể chiếm 23,6 % (14,2 triệu tấn), giáp xác chiếm 9,6 % (5,7 triệu tấn), cá nước lợ chiếm 6,0 % (3,6 triệu tấn), cá nước mặn chiếm 3,1 % (1,8 triệu tấn) và những động vật thủy sản khác chiếm 1.4 % (814 300 tấn)

Theo Tổng Tục Thủy Sản Việt Nam năm 2020 sản lượng tôm của nước ta đạt 556 nghìn tấn, trong đó tôm sú đạt 185 nghìn tấn, tôm Thẻ Chân Trắng đạt 366 nghìn tấn tăng 3 % so với cùng kì năm 2019

Theo báo cáo của Sở Nông nghiệp và PTNT tỉnh Trà Vinh thì trong 9 tháng đầu năm 2020, về nuôi trồng thủy sản, thả nuôi 6,43 tỷ con giống, diện tích 55.776 ha, thu hoạch 110.820 tấn (gồm: cá lóc 35.161 tấn, cá tra 3.921, tôm sú 10.420 tấn, tôm Thẻ Chân Trắng 44.335 tấn ), đạt 75,39 % kế hoạch, cao hơn cùng kỳ 10.418 tấn, trong đó: Vùng nước mặn, lợ, thả nuôi 1,62 tỷ con tôm sú, diện tích 24.301 ha; 4,37 tỷ con tôm Thẻ Chân Trắng, diện tích 6.548 ha; 185 triệu con cua biển, diện tích 22.759 ha (nuôi chuyên 1.906 ha); thu hoạch 61.162 tấn (cao hơn cùng kỳ 5.893 tấn) Tuy nhiên, đầu vụ nuôi do nhiệt độ chênh lệch giữa ngày và đêm lớn, làm cho 151 triệu con tôm sú (chiếm 9,6 % lượng con giống thả nuôi), diện tích 866 ha và 670 triệu con tôm Thẻ Chân Trắng (chiếm 16 % lượng con giống thả nuôi), diện tích 911 ha mới thả nuôi bị

thiệt hại, chủ yếu là bệnh gan tụy, đốm trắng, đỏ thân, vi bào tử trùng, phần lớn tôm chết chủ yếu là ao đất ở giai đoạn từ 25 - 40 ngày tuổi ở một số xã của huyện Châu Thành, Cầu Ngang, Trà Cú, thị xã Duyên Hải Vùng nước ngọt, thả nuôi 261 triệu con tôm, cá giống các loại, diện tích 1.904,5 ha (cá lóc 182,4 triệu con, diện tích 320 ha); thu hoạch 49.657 tấn, cao hơn cùng kỳ 4.524 tấn

1.1.2 Sơ lược về vi khuẩn Vibrio sp gây bênh trên động vật thủy sản

❖ Phân loại khoa học: Ngành: Proteobacteria Lớp: Grammaproteobacteria Bộ: Vibrionales

Họ: Vibrionaceae Chi: Vibrio

Đặc điểm chung của các vi khuẩn Vibrio: hình que thẳng hoặc hơi cong, Gram

âm, không hình thành bào tử, chuyển động nhờ một tiêm mao hoặc nhiều tiêm mao, yếm khí tùy nghi, kích thước 0,3- 0,5 x 1,4-2,6µm, lên men trong môi trường O/F Glucose Hầu hết các loài đều phát triển trong môi trường nước biển cơ bản, Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả các loài Vibrio, chúng không phát triển trong môi trường không muối NaCl, chúng không sinh H2S , mẫn cảm với Vibriostat 2.4 diamino - 6,7 diisopropyl pteridine phosphat (O/129) Cơ bản chúng sống trong môi trường nước biển và cửa sông (vùng nước lợ) (Nguyễn Thị Minh Trang, 2013)

Vibrio sp thường gây bệnh chủ yếu ở động vật thủy sản nước mặn và nước ngọt Κhi động vật thủy sản bị sốc do biến đổi môi trường xấu hoặc bị nhiễm virus, nấm, ký sinh trùng, Chúng sẽ nhân cơ hội thâm nhập vào vật chủ và gây bệnh Sức đề

kháng động vật của thủy sản không có nên khi vibrio sp xâm nhiễm sẽ gây bệnh nặng

và dẫn đến chết rải rác và hàng loạt

Hình 1.1 : Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (Wu et al., 2014)

Bảng 1.1 : Một số bệnh ở động vật thủy sản do Vibrio sp gây ra (Bùi Quang

Tề, 2006)

1 Bệnh phát sáng Ấu trùng, giống

V parahaemolyticus V.harveyi

Gây chết hàng loạt

2 Bệnh đổ dọc thân Ấu trùng giống V.alginolyticus Gây chết rải rác

rác

4 Bệnh vỏ hay ăn mòn kitin, đen mang

ở các giai đoạn tôm, cua

Vibrio spp

Pseudomonas spp Proteus sp

Gây chết rải rác, hàng loạt

5 Nhiễm khuẩn ở cá Cá đầm nuôi, lông

rác

⮚ Trạng thái của động vật thủy sản khi nhiễm Vibrio sp

Tôm nổi lên bề mặt ao, dạt bờ kéo đàn bơi lòng vòng Trạng thái của tôm cua khi bị nhiễm khuẩn thì hôn mê, lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn Tôm có sự biến đổi màu đỏ hay xanh Tôm cua vỏ bị mềm và xuất hiện các vết thương hoại tử ăn mòn trên vỏ và các phần phụ

Hình 1.2 : Tôm sú bị nhiễm khuẩn Vibrio spp.: A- ấu trùng tôm bị bệnh đỏ dọc thân; B- Tôm sú bị bệnh đỏ thân; C- Tôm sú bị bệnh đỏ thân (con thứ 3,4); D- Tôm sú bị bệnh đỏ chân; E- đuôi tôm sú bị ăn mòn; F- đuôi tôm sú bị hoại tử; G- đuôi tôm sú bị đỏ; H- đuôi tôm sú bị phồng; I- tôm sú bị bệnh các phần phụ (râu, chân bò, chân bơi, đuôi) ăn mòn cụt dần (Bùi Quang Tề 2006 Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I)

1.2 Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

Ngành: Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Vibrionales

Họ: Vibrionaceae Chi: Vibrio

Loài: Vibrio parahaemolyticus

V parahaemolyticus là trực khuẩn, Gram âm, hiếu khí và kị khí không bắt buộc, di động bằng tiêm mao và có khả năng trượt trên bề mặt môi trường có độ nhớt cao (McCarter et al., 1999) Nghiên cứu bộ gen của V parahaemolyticus đã xác định được gen mã hoá hemolysin không bền nhiệt (TLH - thermolabile haemolysin) là gen đặc hiệu của loài, gen mã hoá hemolysin bền nhiệt (TDH – thermostable direct haemolysin) mã hoá protein TDH có tác dụng làm vở tế bào máu và gây tan huyết (Iida et al., 1998; McCarthy et al., 1999) Vi khuẩn này còn có thể tiết ra protease và phospholipase làm bất hoạt enzyme gây đông máu ở tôm (Lee et al., 1999)

V parahaemolyticus tồn tại phổ biến ở hệ sinh thái nước mặn và vùng cửa sông

trong đó có các ao nuôi, đặc biệt ở các khu vực Đông Nam Á (Wong et al., 2000)

Nó có thể tồn tại tự do trong môi trường nước và nền đáy, bám trên bề mặt ngoài và xâm nhập vào bên trong cơ thể của các động vật phù du, cá và giáp xác (Kaneko and Colwell, 1973; Kaneko and Colwell ,1975) và phát triển tốt hơn so với các loài vi khuẩn khác trong điều kiện nhiệt độ và độ mặn tương đối cao (Williams and Larock., 1985) Theo Twedt et al (1969) V parahaemolyticus có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ dao động từ 22 – 42ºC với nhiệt đố tối ưu là 37ºC, ngưỡng pH 5 – 11 và nồng độ muối 1 – 7 % Khi nghiên cứu về sự tồn tại của loài vi khuẩn này trong các sản phẩm thủy hải sản đông lạnh khác nhau Vanderzant and Nickelson

(1972) cho biết V parahaemolyticus có thể tồn tại trong khoảng pH từ 5 – 10 và chỉ vô hoạt ở nhiệt độ 80 – 100 ºC trong 15 phút

V parahaemolyticus có khả năng gây dịch bệnh trên người và động vật thủy sản như tôm, cua, nhuyễn thể đặc biệt tôm là loài tương đối nhạy cảm với vi khuẩn này trong tất cả các giai đoạn phát triển (Xie et al., 2005; Lightner, 1996) Trên tôm, V parahaemolyticus thường được phân lập trong máu và gan tụy (Lighner, 1996; Bruno et al., 1998; Sung et al., 2001) Các chủng V

parahaemolyticus cùng với V harveyi, V vulnificus gây chết hàng loạt trên tôm

nuôi ở Thái Lan (Nash et al., 1992) và Philiphine (Lavilla – Pitogo et al., 1998) có

liên quan đến một số bệnh nhiễm khuẩn cục bộ và nhiễm khuẩn trên gan tụy trên tôm sú (Lightner, 1996)

1.3 Hội chứng hoại tử gan tụy – cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome – AHPNS

Bệnh do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra, bệnh xuất hiện vào năm 2011 tại Việt Nam tập trung chủ yếu ở vùng ĐBSCL gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghành tôm tại Việt Nam V parahaemolyticus tích hợp với phage độc tương thích tạo ra một độc tố mạnh làm phá hủy mô và làm rối loạn chức năng gan tụy Tôm mắc bệnh gan tụy cấp có những triệu chứng lâm sàng như gan tụy teo, dai, vỏ mềm, ruột rỗng, đôi khi cuất hiện những đốm đen đen có thể thấy bằng mắt thường Tôm có thể chế đáy hoặc chết cấp tính khi xuất hiện dấu hiệu bệnh từ 2- 4 ngày Đặng Thị Hoàng Oanh et

al (2012)

Theo Lightner., et al (2013) năm 2009 bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm biển lần đầu tiên được phát hiện hay còn được gọi là “Hội chứng tôm chết sớm- EMS (Early Mortality Syndrome)” Dựa trên mô tả bệnh tích cấp tính năm 2011 một tên mới được đặt ra gọi là “Hội chứng gan hoại tử cấp” (AHРNS- Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome) Vào năm 2013 tên gọi “bệnh hoại tử gan tụy cấp” (AHPND- Acute Heapatopancreatic Necrosis Disease) được dùng khi tác nhân gây bệnh được xác định Bệnh gây tác hại lớn trên tôm sú, tôm Thẻ Chân Trắng ở các trang trại nuôi tôm Mê Hi

Cô, Đông Nam Á và Thái Bình Dương Bệnh AHРND ban đầu được phân loại là bệnh không rõ nguyên nhân vì không có mầm bệnh chuyên biệt nào được xác nhận Tuy nhiên vào đầu năm 2013, phòng nghiên cứu Bệnh học thủy sản Trường đại học Arizona (UAZ-AРL) đã phân lập được dòng vi khuẩn gây bệnh AHPND là Vibrio

Parahaemolyticus từ mầm bệnh của hai nước Việt Nam và Mê Hi Cô

1.4 Sơ lược về vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic bao gồm một số giống: Carnobacterim, Enterococcus,

Lactpbacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella thuộc ngành Fermicute (Ercolini et al., 2001)

Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn gram dương (Fooks et al., 1999), lên men carbon hydrate cacbon khi có hoặc không có oxy và tạo sản phẩm cuối cùng là acid lactic (Jay, 2000) Nhóm vi khuẩn lactic này còn sản xuất ra các hợp chất hữu cơ tạo ra mùi thơm và hương vị cho các sản phẩm lên men (Caplice & Fizgerald, 1999)

Theo khóa phân loại Bergey (2001) vi khuẩn Lactic được xếp vào 4 họ:

Lactobacillaceae, Enterococcaceae, Leuconoscaceae, Streptococcaceae, thuộc: Giới: Bacteria

Ngành: Firmicutes

Lớp: Bacilli

Bộ: Lactobacillales Họ I: Lactobacillaceae

Giống: Lactobacillus; Pediococcus Họ II: Enterococcaceae

Giống: Enterococcus Họ III: Leuconoscaceae Giống: Leuconostoc Họ IV: Streptococceae

Giống: Streptococcus; Lactococcus

1.4.1 Thành phần kháng khuẩn được sinh ra từ vi khuẩn lactic

Tác động kháng khuẩn chủ yếu được sinh ra từ vi khuẩn lactic chủ yếu là acid lactic và các sản phẩm acid hữu cơ do chúng sinh ra Chúng sinh acid làm giảm pH môi

trường sống của các vi sinh vật khác (Caplice & Fitzgerald, 1999; Kuipers et al.,

2000) Ở pH thấp acid hữu cơ sẽ chuyển thành lipid hòa tan và khuyếch tán qua màng tế bào chất (Gottschalk, 1988)

Ngoài ra vi khuẩn lactic cũng sinh ra các hợp chất kháng khuẩn khác như: acetadehyde, H2O2, CO2, đường đa, diacetyl và bacteriocins (Caplice & Fitzgerald; de

Vuyst & Degee, 1999)

1.4.2 Phân lớp vi khuẩn lactic từ bacteriocin

Các vi khuẩn được phân loại dựa trên cấu trúc cơ bản của phân tử, trọng lượng phân tử, các biển đổi sau dịch mã và đặc điểm di truyền

Bảng 1.2 : Các lớp và tính chất bacteriocin từ vi khuẩn lactic (Mokoena, M

Chứa các acid amin duy nhất là lanthionine và methyllanthionine; <5 kDa

nisin, lactocin, mersacidin

IIa Leuconostoc gelidum Các peptit bền nhiệt, không biến tính, cation, kỵ nước; chứa một peptit đầu kép glycine; peptit giống pediocin; <10 kDa

pediocin PA1, sakicin A, leucocin A

IIb Enterococcus faecium Yêu cầu tổng hợp của hai peptit bổ sung; chủ yếu là peptit cation

lactococcin G, plantaricin A, enterocin X

IIc Lactobacillus acidophilus

Ảnh hưởng đến tính thấm của màng và sự hình thành thành tế bào

acidocin B, entereocin P, reuterin 6

III Lactobacillus helveticus

Không bền nhiệt; khối lượng phân tử peptide lớn; > 30 kDa

lysostaphin, enterolysin A, helveticin J

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm Thực hiện

- Đĩa petri - Que cấy vòng - Cồn 70o

, 90o- Đèn cồn - Ống ly tâm - Cây đục lỗ - Micropipett - Tủ ấm - Máy li tâm - Đầu col - Kính hiển vi - Bộ nhuộm gram

2.3 Phương pháp

2.3.1 Thu thập và lưu trữ mẫu

Mẫu tôm, cá, bùn, nước nuôi tôm được thu ở thị xã Duyên hải, thị trấn Cầu Kè, thị trấn Trà Cú trên địa bàn tỉnh Trà Vinh Mẫu ao tôm nuôi thâm canh, quảng canh kích cỡ tôm 20 g/con Mẫu cá rô phi khỏe được thu ở các ao kết hết hoặc các ao tự nhiên Kích cỡ các thu mẫu khoảng 100 g/con Mẫu bùn cũng được thu ở các ao nuôi thâm canh và quảng canh Mẫu nước nuôi tôm được thu ở những điểm khác nhau trong ao (đầu, giữa và cuối ao) Mẫu nước của cùng một ao sau khi thu về sẽ cho trộn lẫn vào nhau

Mẫu được trữ lạnh ở 4 oC để đưa về phòng thí nghiệm, sau đó được đem đi phân tích ngay Chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolytiucs được cung cấp bởi phòng R&D (Research and Development) vi sinh thuộc công ty cổ phần Mỹ Lan tỉnh Trà Vinh

2.3.2 Tiến hành thí nghiệm:

Mẫu tôm và cá sau khi đem về được khử trùng bằng cồn 70º tráng lại bằng nước cất vô trùng tiến hành giải phẫu tách lấy phần ruột Ruột sau tách được đem ghiền nhuyễn với 5ml nước muối sinh lí vô trùng đến dung dịch đồng nhất, hút 1ml dịch vào 5ml môi trường MRS, ủ ở 37ºC, 48 giờ Mẫu sau tăng sinh tiến hành pha loãng trong nước 0,85% NaCl ở nồng độ: 10-1

, 10-2 , 10-3 , 10-4 , 10-5 , 10-6 , Hút 50µL dịch pha loãng trải trên đĩa môi trường MRS agar bổ sung 1% CaCO3, ủ ở 48 giờ, 37 ºC

Tiến hành cân 1 g mẫu bùn hòa trong 9 ml nước muối sinh lí, dùng micropipet hút 1mL dịch nổi vào 5 mL môi trường MRS ủ 48h, 37ºC Đối với mẫu nước nuôi tôm hút trực tiếp 1ml tăng sinh trong 5mL môi trường MRS ủ 37ºC Mẫu sau tăng sinh cũng được pha loãng ở các nồng độ và trải trên môi trường MRS agar tương tự như mẫu ruột các và tôm

Sau khi ủ chọn những khuẩn lạc có vòng tan CaCO3 tiếp tục cấy ria trên đĩa thạch môi trường MRS agar đến khi khuẩn lạc có hình dáng kích thước và màu sắc giống nhau

Khuẩn lạc sau khi làm thuần sẽ được quan sát dưới kính hiển vi, chọn những khuẩn lạc Gram dương, có hình cầu hoặc que Thử nghiệm một số khả năng sinh hóa của vi khuẩn lactic bằng một số test sinh hóa: nhuộm Gram, test catalase, khả năng sinh Indol, di dộng, gelatinase, khả năng sinh bào tử., oxidase… để định danh sơ bộ vi khuẩn thuộc chủng lactic

Trữ các dòng thuần trong môi trường MRS broth bổ sung 25% glycerol, -80ºC để thực hiện các thí nghiệm kế tiếp

2.3.3 Sàng lọc vi khuẩn lactic bằng các chỉ tiêu hình thái, sinh lí và sinh hóa

Các khuẩn lạc sau khi được làm thuần trên môi trường MRS agar được đem đi quan sát đại thể, vi thể Thử nghiệm một số test sinh hóa để định danh sơ bộ vi khuẩn lactic từ các chủng phân lập được

Chỉ tiêu hình thái và các đặc tính sinh hóa được quan sát theo Kandler and Wiss, 1986

Nhuộm Gram

Mục đích: Xác định vi khuẩn Gram âm hay Gram dương

Nguyên tắc: Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày, dạng lưới cấu tạo bởi peptidoglycan có khả năng giữ được phức hợp tím tinh thể i-ot Vi khuẩn Gram âm có lớp peptidoglycan mỏng nên sau bước khử màu sẽ không giữ lại được phức hợp tím tinh thể i-ot

Các bước tiến hành:

Khử trùng lamen và lam kính bằng cồn 96º Lấy 1 giọt nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội Sau đó lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng trên kính mang vật Hơ thật nhanh trên ngọn lửa đèn cồn để cố định mẫu trên kính mang vật Nhỏ 1-2 giọt Crystal Violet lên kính mang vật có cố định mẫu, dùng que cấy trải đều Crystal Violet, giữ yên trong 2 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng Tiếp tục nhỏ 1-2 giọt Lugol rồi tải đều bằng que cấy để yên trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng Rửa lại bằng cồn 96º thật nhanh sao cho kính mang vật không còn bám màu tím của Crystal Violet Nhỏ từ 1-2 giọt SafaminO rồi

trải đều bằng que cấy sau đó để yên 1 phút và rửa lại bằng nước cất vô trùng, thấm khô nước Quan sát mẫu dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100X

Thử khả năng di động trên môi trường thạch mềm 0,5% agar

Nguyên tắc: Một số vi khuẩn có tiêm mao (Flagella) nên có khả năng di động trong môi trường bán lỏng hoặc làm đục môi trường hay mọc giống như rễ cây xung quanh đường cấy

Tiến hành: Lấy sinh khối của vi khuẩn bằng que cấy thẳng, cấy thẳng đứng từ trên xuống dưới trong môi trường thạch bán lỏng, ủ 24 giờ, 37ºC

Đọc kết quả: Di động (+) vi khuẩn mọc lan ra khỏi đường cấy Κhông di động ) vi khuẩn chỉ mọc trên đường cấy

Tiến hành: Cấy vi khuẩn lên môi trường Simoms Citrate ủ 37o

C, 24h Đọc kết quả:

- Xanh bromothymol chuyển từ màu lục sang màu xanh dương: Citrate (+)

- Xanh brothymol vẫn giữ nguyên màu xanh lục: Citrate (-)

Thử khả năng sinh Indol:

Nguyên tắc: Vi sinh vật tiết enzym Tryptophannase, chuyển hóa Tryptophan thành Indol, Indol sẽ kết hợp với para- dimethylaminobenzaldehyd trong thuốc thử Κowac’s tạo phức chất đỏ Rosindol màu đỏ

Tiến hành: Cấy vi khuẩn vào môi trường Nutrient Broth, pH ≈ 7, ủ 37ºC, 24 giờ sau đó nhỏ 3-5 giọt Κowac’s và đọc kết quả

Thử khả năng phân giải gelatin

Cơ chế: Một số vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzym gelatinase ngoại bào thủy phân gelatin thành polypeptide và axit amin làm phá hủy đặc tính đông đặc của gelatin ngay khi ở tº <25º C và hóa lỏng ở tº >25ºC

Tiến hành: cấy thẳng vi khuẩn vào môi trường NB bổ sung 10% gelatin, pH≈7, Ủ 24 giờ, 37ºC , thực hiện song song với ống đối chứng không cấy khuẩn

Đọc kết quả: Sau khi ủ lấy ống khuẩn và ống đối chứng cho vào ngăn mát tủ lạnh 30 phút, 1 giờ

Môi trường hóa lỏng (+) Môi trường đông đặc (-)

Thử nghiệm KIA (Kligler Iron Agar)

Cơ chế: Test ΚIA được sử dụng để kiểm tra đồng thời 2 khả năng là khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau và khả năng sinh H2S Vi khuẩn cấy lên môi trường này có 3 trường hợp:

Chỉ sử dụng glucose: sau 18- 24 giờ, phần nuôi cấy nghiêng có pH trở nên kiềm, phần nuôi cấy đứng có pH acid Do glucose trên bề mặt của môi trường được vi sinh

vật sử dụng oxi hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O để thu năng lượng Để đáp ứng nhu cầu năng lượng trong tăng trưởng vi sinh vật tiếp tục dị hóa peptone qua đó giải phóng NH3 làm phần bề mặt của môi trường có pH kiềm Phần sâu trong môi trường có điều kiện oxi không đầy đủ, glucose lên men kị khí sinh các acid hữu cơ làm pH môi trường giảm

Sử dụng cả glucose và lactose: sau 18- 24 giờ toàn bộ môi trường đều trở nên có pH acid vì sự biến dưỡng đồng thời cả hai loại đường giúp vi sinh vật đủ năng lượng để tăng trưởng mà chưa cần sử dụng đến peptone Khi thời gian nuôi cấy quá dài bề mặt môi trường sẽ trở nên kiềm do vi sinh vật sử dụng hết nguồn Carbon trong môi trường và phải sử dụng đến peptone

Không sử dụng glucose và lactose: Bề mặt môi trường sẽ trở nên kiềm hóa do vi sinh vật biến dưỡng nguồn peptone chỉ trong điều kiện kị khí

Khả năng sinh H2S: vi sinh vật khử sufate có thể khử sodium thiosufate nhờ có enzyme thiosunfat reductase để giải phóng H2S, H2S phản ứng với Fe2+ của chỉ thị ferric amonium citrate tạo kết tủa màu đen FeS

Cách tiến hành: Dùng quen cấy thẳng vi sinh vật vào môi trường KIA cấy thẳng sâu vào ống nghiệm, không chạm đáy, sau đó ria lên bề mặt thạch nghiêng, ủ 24 giờ, 37º C và đọc kết quả

Tiến hành: Cấy vi khuẩn vào môi trường Clack-Lubs pH≈7, ủ 37oC, 48 giờ, lấy ra nhỏ 5- 10 giọt MR

Tiến hành: Cấy vi khuẩn vào môi trường Clack-Lubs, ủ 37o C, 24 giờ lấy ra nhỏ khoảng 10 giọt NaOH 40%, hơn nóng nhẹ nhỏ tiếp khoảng 5- 10 giọt α-naphtol lắc nhẹ đều để yên 5-10 phút

Các chủng vi khuẩn sau khi phân lập và thử một số khả năng sinh hóa được định danh sơ bộ thuộc vi khuẩn lactic được đem tăng sinh trong môi trường MRS borth 48 giờ, 37º C, 5% CO2 Dịch nuôi cấy được ly tâm 10.000 rpm trong 20 phút ở 4ºC để loại bỏ sinh khối của vi khuẩn, thu dịch nổi (phần dịch trong)

Đối với chủng vi khuẩn V paraheamolyticus

Chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus được cung cấp bởi phòng R&D vi sinh cong ty cổ phần Mỹ Lan Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường NB bổ sung 1,5% NaCl, ủ 37ºC, 24h, sử dụng ống MCFarland 0.5 để đưa về mật độ 1-2x108

CFU/mL

Tiến hành:

Hút 50µL dịch khuẩn này trải trên đĩa môi trường NA + 1,5% NaCl băng tăm

bông vô trùng Sau đó tạo giếng 6mm trên đĩa thạch đã trải V.parahaemolyticus Hút

50µL dịch ly tâm khuẩn đã phân lập được vào các giếng đã tạo trước đó Ủ 24h, 37ºC

Đọc kết quả:

Sau 24 giờ ủ, đem mẫu ra quan sát, đo vòng vô khuẩn và ghi nhận kết quả Khả năng kháng khuẩn được chia làm 3 loại: (+): vòng vô trùng yếu<11 mm; (++): vòng vô trùng trung bình 11-16 mm; (+++): Vòng vô trùng lớn > 16 mm (Ngô Thị Рhương Dung et al., 2012)

Thử nghiệm khả năng sinh bacteriocin và hoạt tính kháng Vibrio

Những dòng vi khuẩn lactic có khả năng Vibrio parahaemolyticus mạnh được kiểm tra bằng phương pháp khuyếch tán giếng thạch như phương pháp trên nhưng được điều chỉnh pH về 6,4

Dịch trong sau khi ly tâm được điều chỉnh về pH 6,4 và thực hiện giống như

phương pháp trên Рhương pháp được thực hiện theo Schillinger (1989) và Venema et

al (1997)

Tiến hành dùng micropipet hút 50µL dịch bacteriocin của các dòng lactic phân lập được bơm vào các giếng đã tạo trên đĩa thạch NA +1,5% NaCl đã trải Vibrio

parahaemolyticus Ủ 24h, 37ºC quan sát kết quả

2.3.5 Xác định, chọn lọc tính kháng khuẩn:

Hoạt tính kháng khuẩn của những dòng vi khuẩn lactic phân lập được xác định bằng đường kính vòng vô khuẩn quanh miệng giếng Κích thước vòng vô khuẩn trên 2mm được tính là vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn từ đó chọn lọc những dòng lactic có khả năng kháng mạnh nhất

2.3.6 Thử nghiệm các nồng độ muối khác nhau lên mật số của vi khuẩn:

Tiến hành thí nghiệm: nghiệm thức được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức nghiệm thức và 3 lần lặp lại đối với từng chủng khuẩn Chuẩn bị các ống môi trường MRS với các nồng độ mặn sau: 5, 10, 15, 20, 25‰ Tiến hành đưa mật độ vi khuẩn lactic về 1-2x108 CFU/mL, ly tâm thu cặn cho vào ống môi trường MRS với các nồng độ mặn đã nêu trên, ủ ở 37oC và quan sát mật số vi khuẩn ở các mốc thời gian lần lượt là: 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ

Рhương pháp kiểm tra mật số là phương pháp đếm mật số vi khuẩn trên đĩa thạch petri Vi khuẩn sau các mốc thời gian đã nuối ủ đem pha loãng ở các nồng độ khác nhau trên trên đĩa thạch môi trường MRS ủ 48 giờ và đếm mật số Ghi nhận nồng độ muối và thời gian nuôi thích hợp của từng loại vi khuẩn

Thống kê và phân tích kết quả bằng phần mềm Statgraphics plus

2.3.7 Định danh dòng vi khuẩn lactic bằng phương pháp giải trình tự 16s

Chủng vi khuẩn chọn lọc được ly trích DNA và khuyếch đại trình tự 16s Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự vi khuẩn trên ngân hàng dữ liệu của NCBI bằng công cụ Nucleotide BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)