sàng lọc vi khuẩn bacillus có khả năng kiểm soát sinh học vi nấm colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây ớt

SÀNG LỌC VI KHUẨN Bacillus CÓ KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC VI NẤM Colletotrichum sp

GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY ỚT

«1'

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là : Nguyễn Duy Thùy

Ngày sinh: 06/10/1999 Nơi sinh: Quảng Ngãi

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã học viên: 1753010245 Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh

Ký tên

(Ghi rõ họ và tên)

Giảng viên hướng dẫn: Ths Nguyễn Văn Minh – Ths Dương Nhật Linh Học viên thực hiện: Nguyễn Duy Thùy Lớp: DH17NN01 Ngày sinh: 06/10/1999 Nơi sinh: Quảng Ngãi

Tên đề tài: SÀNG LỌC VI KHUẨN BACILLUS CÓ KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC

VI NẤM COLLETOTRICHUM SP GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY ỚT

Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép học viên được bảo vệ khóa luận trước Hội đồng: Đồng ý cho sinh viên được bảo vệ

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 02 năm 2022

Người nhận xét

Nguyễn Văn Minh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành chuyên đề báo cáo khóa luận này trước hết em xin gửi đến quý Thầy, Cô giảng viên trong Khoa Công nghệ sinh học Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh lời cảm ơn chân thành nhất Các Thầy, Cô đã cho em những kiến thức bổ ích Đặc biệt là khoảng thời gian mà em đã gắn bó với phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh, đây là nơi đã để lại cho em rất nhiều kỷ niệm đáng nhớ của thời sinh viên là nơi cho em nhiều bài học quý giá không chỉ là những bài học thực hành mà còn là bài học về kinh nghiệm sống, cách sống, cách ứng xử với nhau trong ngôi nhà chung Vì vậy để hoàn thành tốt đề tài này em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Thầy Cô, Anh Chị, Bạn bè và Gia đình

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy ThS Nguyễn Văn Minh và Cô ThS Dương Nhật Linh Thầy cô luôn là người đã theo sát và hướng dẫn em

tận tình những lúc em gặp khó khăn, cho em những lời khuyên và định hướng tốt nhất cho đề tài em đạt được kết quả như mong đợi

Em xin cảm ơn đến quý Thầy, Cô, anh chị Quản lý phòng thí nghiệm, Trợ lý Sinh Viên khoa Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh đã hết lòng giảng dạy cho em những kiến thức và hiểu biết vững chắc, cảm ơn các anh chị đã luôn tạo điều kiện về thiết bị và thời gian thích hợp để em có thể hoàn thành đề tài

Em xin cảm ơn chị Trần Thị Á Ni, chị Nguyễn Thị Thảo Nguyên, anh Nguyễn Hoài Linh đã luôn tận tình giúp đỡ em giải quyết các vấn đề hay gặp khó

khăn trong lúc thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Hoàng Minh, anh đã luôn giúp em có

được nguồn mẫu ớt bệnh, luôn sẵn sàng tìm mẫu ớt bệnh cho em bất cứ lúc nào em

Bên cạnh đó em xin gửi lời cảm ơn đến tất các các bạn và các em cùng làm đề tài tại phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh – Trường đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh đã luôn hỗ trợ em những lúc em gặp khó khăn nhất

Con xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Ba Mẹ người đã sinh thành nuôi dưỡng con đến ngày hôm nay, cảm ơn Ba Mẹ đã luôn động viên và giành cho con

những lời khuyên bổ ích luôn tạo cho con có một điều kiện tốt nhất để con có một môi trường học tập, nghiên cứu tốt và có thể hoàn thành việc học của con để phụ giúp gia đình

Cuối cùng, kính chúc tất cả quý Thầy Cô, Cô Chú, Anh Chị, bạn bè, cả Gia đình dồi dào sức khỏe, luôn luôn hạnh phúc và đạt được nhiều thành công trong cuộc sống Em xin chân thành cảm ơn

Tp Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2021

Nguyễn Duy Thùy

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CFU: Colony Forming Unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc

ITS: Internal Transcribed Spacer - vùng phiên mã bên trong

NCBI: National Center for Biotechnology Information

Bảng 3.1 Kết quả quan sát hình thái đại thể các chủng vi khuẩn 39

Bảng 3.2 Kết quả quan sát hình thái vi thể các chủng vi khuẩn Bacillus sp 40Bảng 3.3 Kết quả sàng lọc khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus sp với vi nấm Colletotrichum gloeosporioides C79 41Bảng 3.4 Kết quả đánh giá phần trăm ức chế sinh học vi nấm Colletotrichum gloeosporioides C79 của 7 chủng vi khuẩn Bacillus sp 43Bảng 3.5 Kết quả khảo sát phần trăm ức chế sinh học vi nấm Colletotrichum gloeosporioides C79 của các chủng vi khuẩn Bacillus 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây ớt (Capsicum annuum) Nguồn: Internet 6

Hình 1.2 Colletotrichum sp gây bệnh trên quả (A), Colletotrichum sp gây bệnh trên lá (B) 10

Hình 1.3 Chu kì gây bệnh của vi nấm Colletotrichum sp 11

Hình 1.4 Cơ chế xâm nhiễm của vi nấm Colletotrichum sp.vào tế bào ớt 12

Hình 3.1 Mẫu ớt có biểu hiện của vi nấm Colletotrichum sp C79 xâm nhiễm 31

Hình 3.2 Kết quả làm thuần nấm Colletotrichum sp C79 bằng phương pháp cấy đơn bào tử trên môi trường PDA (A) Vi nấm Colletotrichum sp C79 trên ớt, (B) Vi nấm Colletotrichum sp C79 đã được làm thuần 32

Hình 3.3 Kết quả quan sát đại thể vi nấm Colletotrichum sp C79: (A) Mặt trên đĩa nấm, (B) Mặt dưới đĩa nấmB 32

Hình 3.4 Kết quả quan sát vi thể vi nấm Colletotrichum sp C79: (A) Quan sát ở vật kính 10X, (B) Quan sát ở vật kính 40X.B 33

Hình 3.5 Kết quả gây bệnh nhân tạo nấm Colletotrichum sp C79 lên ớt: (A) Mẫu ớt khỏe mạnh, (B) Mẫu ớt sau 4 ngày gây bệnh, (C) mẫu ớt sau 10 ngày gây bệnh 35

Hình 3.6 Kết quả BLAST trên NCBI chủng vi nấm Colletotrichum sp C79 36

Hình 3.7 Kết quả xây dựng cây phả hệ Maximum Likelihood method 37

Hình 3.8 Kết quả xây dựng cây phả hệ Neighbor-Joining method 38

Hình 3.9 Kết quả xây dựng cây phả hệ Maximum Parsimony method 38

Hình 3.10 Kết quả quan sát đại thể của mốt số vi khuẩn (A) chủng Bacillus polyfermenticus F27, (B) chủng Bacillus sp KT2 40Hình 3.11 Kết quả quan sát vi thể một số vi khuẩn Bacillus (A) chủng Bacillus

KT2, (B) Bacillus polyfermenticus F27 42

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Biểu đồ thể hiện phần trăm ức chế vi nấm Colletotrichum

gloeosporioides C79 của các chủng vi khuẩn Bacillus sp 44

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 21

PHẦN I:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Cây ớt (Capsicum annuum) 6

1.1.1 Giới thiệu chung 6

1.1.2 Phân loại 6

1.1.3 Đặc điểm 7

1.1.4 Giá trị dinh dưỡng 7

1.2 Bệnh thán thư trên cây ớt 8

1.2.1 Giới thiệu chung 8

1.2.2 Phân loại 9

1.2.3 Triệu chứng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum sp gây ra 10

1.2.4 Cơ chế gây bệnh thán thư do vi nấm Colletotrichum sp 10

1.4 Bacillus sp và chất chuyển hóa kháng nấm của Bacillus sp 17

1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước của Bacillus sp kháng nấm bệnh thán thư 18

PHẦN II:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 21

2.2 Vật liệu nghiên cứu 22

2.3 Thiết bị, dụng cụ, môi trường 22

2.3.1 Thiết bị 22

2.3.2 Dụng cụ 22

2.3.3 Môi trường, hóa chất và thuốc nhuộm 23

2.4 Phương pháp nghiên cứu 23

2.4.1 Phân lập nấm gây bệnh thán thư Colletotrichum sp 23

2.4.2 Làm thuần 24

2.4.3 Quan sát đại thể và vi thể các mẫu nấm bệnh thán thư phân lập được 24

2.4.4 Gây bệnh nhân tạo các chủng vi nấm Colletotrichum sp lên quả ớt 25

2.4.5 Định danh chủng nấm gây bệnh thán thư Colletotrichum sp 25

2.4.6 Sàng lọc khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus sp với nấm Colletotrichum sp 26

2.4.7 Đáng giá phần trăm ức chế của chủng vi khuẩn Bacillus sp đối với chủng vi nấm Colletotrichum sp 28

PHẦN III:KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Kết quả phân lập, định danh sơ bộ và làm thuần chủng vi nấm Colletotrichum sp C79 31

3.1.1 Mô tả vết bệnh thán thư do chủng vi nấm Colletotrichum sp.C79 31

3.1.2 Kết quả phân lập, định danh sơ bộ và làm thuần chủng vi nấm Colletotrichum sp C79 31

3.2 Kết quả quan sát đại thể và vi thể vi nấm Colletotrichum sp C79 33

3.2.1 Kết quả quan sát đại thể vi nấm Colletotrichum sp C79 33

3.2.2 Kết quả quan sát vi thể vi nấm Colletotrichum sp C79 34

3.3 Gây bệnh nhân tạo vi nấm Colletotrichum sp C79 lên ớt 35

3.4 Định danh sinh học phân tử vi nấm Colletotrichum sp C79 36

3.5 Kết quả sàng lọc khả năng đối kháng sinh học của các chủng vi khuẩn Bacillus sp với vi nấm Colletotrichum gloeosporioides C79 39

3.5.1 Hoạt hóa các chủng vi khuẩn Bacillus sp 39

3.5.2 Kết quả sàng lọc khả năng đối kháng của chủng vi khuẩn Bacillus sp với vi nấm Colletotrichum gloeosporioides C79 41

3.5.3 Kết quả đánh giá phần trăm ức chế vi nấm Colletotrichum

gloeosporioides C79 của các chủng vi khuẩn Bacillus sp 43

PHẦN IV:KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

4.1 Kết luận 49

4.2 Kiến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 58

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây ớt (Capsicum annuum) là một loại cây gia vị có nguồn gốc từ rất lâu đời

khoảng 7500 năm trước Công nguyên hoặc sớm hơn Được trồng khắp nơi ở Việt Nam và cũng được trồng nhiều nước trên thế giới như Nhật Bản, Indonesia, Ấn Độ nhất là Hungari người ta trồng hàng nghìn hecta, mỗi năm xuất cảng từ 2500 đến 3000 tấn ớt khô (Đỗ Tất Lợi, 2004) Do đó mà ngày nay diện tích trồng ớt đã tăng lên rất nhiều nhưng năng xuất thật sự chưa cao Là loại cây dễ trồng nhưng rất tốn công chăm sóc và luôn gặp những tổn thất lớn trong vấn đề về dịch bệnh đặc biệt là bệnh

thán thư do nấm Colletotrichum gây ra, theo (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010) hiện nay nấm Colletotrichum được mô tả có 11 loài (Von Arx, J A., 1957);

(Sutton, BC, 1962) Nhưng (Alexopoulos, Mims, & Blackwell, 1979) thì đề xuất trên 1000 loài hình thức trong giống này đã được mô tả trước đây, phần lớn chúng trùng

tên Theo ý kiến gần đây nhất của (Baxters, 1985) Colletotrichum được giới thiệu có 11 loài: C coccodes, C.gloeosprioides, C graminicola, C capsici là những loài

thường gây bệnh thán thư Bệnh lây lan mạnh do bào tử nấm phát tán xa và nhiều theo gió Vì vậy, đây là dịch bệnh nghiêm trọng và gần như bất trị dù có phun nhiều loại thuốc đặc trị Bệnh xuất hiện trên lá, thân và đặc biệt là trên trái làm giảm năng xuất và chất lượng nông sản từ 28 – 35 %, thiệt hại lên đến 70 – 80 % Theo Than et

al (2008) Colletotrichum là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng nhất trên

toàn thế giới gây ra bệnh thán thư trên một loạt các cây trồng bao gồm ngũ cốc, các loại đậu, rau, cây lâu năm và cây ăn quả (Bailey JA, 1992)

Vì thế vấn đề đối phó với bệnh thán thư là vô cùng quan trọng Hiện nay tại các vùng trồng ớt phương pháp đối phó chủ yếu là phương pháp canh tác như luân canh với cây không thuộc họ cà, tiêu hủy phế phẩm, lên luống, tưới rửa cây sau mưa, bón vôi vào đất diệt mầm bệnh, xử lí hạt giống trước gieo trồng (Lisa Kitinoja, 2002) Tuy có giảm được một phần nào dịch bệnh những chủ yếu là để phòng bệnh còn lúc ruộng ớt đã bị bệnh thì phải sử dụng phương pháp hóa học bằng cách phun một số thuốc trừ nấm như Amista, Loverice, Melody duo 66, Ringo-L 20SC, Amistar250SC,

thuốc bảo vệ thực vật quá giới hạn trên nông sản gây độc cho sản phẩm, làm giảm uy tín và giá trị sản phẩm cũng như gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự ổn định và bền vững của hệ sinh thái Trong những năm gần đây xu thế tất yếu trong lĩnh vực bảo vệ thực vật ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung là hướng tới sử dụng các phương pháp sinh học thân thiện với môi trường đưa nền nông nghiệp tiến tới nền nông nghiệp hữu cơ Đặc biệt là việc ứng dụng các vi sinh vật thiên địch trong việc sản xuất các chế phẩm phòng trừ dịch bệnh cây trồng

Một trong những vi sinh vật được nghiên cứu trong sản xuất chế phẩm sinh học

là Bacillus và một số chủng khác như B.amyloliquefaciens và B.licheniformis an toàn

với người và động vật và có khả năng tổng hợp được nhiều loại kháng sinh đối kháng được với nấm bệnh và một số vi khuẩn khác đã được nghiên cứu thành công ở nhiều nước trên nhiều đối tượng khác nhau (Nguyễn Thị Thúy Hồng, 2015) Ngoài ra

Bacillus còn có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh tự nhiên như Bacitracin,

Bacilysin, Baxilomicin (A,B,C,R), Bacillopectin, Mycobacillin, Subtilin (A,B,C), Prolimicin… có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, tác dụng lên cả vi khuẩn gram âm lẫn gram dương, nấm gây bệnh (Giáng Hương,

2016) Ngoài ra đã có các nghiên cứu liên quan như Chủng Bacillus subtilis cũng được chứng minh có hiệu quả trong đối kháng Colletotrichum gloeosporioides gây

bệnh thán thư trên ớt với khả năng ức chế nấm bệnh là 56,86 % (Ngullie M., 2010)

Với những lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “SÀNG LỌC VI

KHUẨN Bacillus CÓ KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT SINH HỌC VI NẤM

Colletotrichum sp GÂY BỆNH THÁN THƯ TRÊN CÂY ỚT.”

Mục tiêu:

Sàng lọc các chủng vi khuẩn Bacillus sp có khả năng kiểm soát sinh học vi nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây ớt

Nội dung thực hiện

- Phân lập và định danh sơ bộ chủng vi nấm Colletotrichum sp từ mẫu trái ớt bệnh thán thư và gây bệnh nhân tạo chủng vi nấm Colletotrichum sp lên trái

PHẦN I:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây ớt (Capsicum annuum)

1.1.1 Giới thiệu chung

Cây ớt là một loại gia vị được trồng rộng rãi trên thế giới và có tầm quan trọng trong thực phẩm của con người, có nguồn gốc từ Nam và Trung Mỹ (Dias GB, 2013); (Wahyuni Y, 2013) Đến nay ớt đã được trồng rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới bao gồm vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và các vùng có khí hậu ôn hòa (Momol, Ken Pernezny and Tim, 2006)

Cây ớt thuộc học Cà (Solanaceae) chi ớt (Capsicum) có hơn 25 loài

trong đó chỉ có 5 loài C.annuum, C chinense, C baccatum, C frutescens và C pubescens được thuần hóa và trồng ở nhiều nới trên thế giới Trong 5 loài được trồng trên thì C.annuum là một trong những loài được trồng

phổ biến nhất trên thế giới (Tong N, Bosland PW, 1999) tiếp theo đó là

C frutescens ( Bosland PW, Votava EJ, 2003) 1.1.2 Phân loại

Giới: Plantae

Ngành: Magnoliophyta

Lớp: Equisetopsida

Phân lớp: Magnoliidae Bộ: Solanales

Họ: Solanaceae

Chi: Capsicum

Loài: Capsicum annuum

Hình 1.1 Cây ớt (Capsicum annuum) Nguồn: Internet

1.1.3 Đặc điểm

Ớt thuộc loài thân thảo mọc tại những nước ôn đới, sống lâu năm và thân phía dưới hóa gỗ ở những nước nhiệt đới Cây có nhiều cành Lá mọc so le, hình thuôn dài, đầu nhọn, phía cuống cũng thuôn hẹp, có cuống, phiến lá dài 2 - 4 cm, rộng 1,5 – 2 cm Quả mọc rũ xuống hoặc quay lên trời, hình dáng thay đổi, khi thì tròn, khi thì dài, đầu nhọn Quả chưa chín có màu xanh hoặc tím, quả chín màu vàng hoặc đỏ Có loại rất cay, có loại ít cay tùy theo giống và điều kiện canh tác (Đỗ Tất Lợi, 2004) Hạt ớt nhỏ dẹp, dạng thận, màu vàng rơm, chiều dài khoảng 3 – 5 mm Cây thường cao khoảng 0,5 – 1,5 m Ớt có rễ cọc với nhiều rễ phụ nhưng trong gieo trồng việc cấy chuyển cây làm rễ bị đứt và phát triển thành một hệ rễ chùm

Theo khóa phân loại của Paul G Smith Capsicum annuum có cánh

hoa đồng màu, từ trắng đến xanh vàng sáp (không có đốm hay màu tương phản khác) Bao phấn xanh tái đến tím Hoa đơn độc (đôi khi 2 hoa trên mắt đầu tiên), tràng hoa trắng hoặc trắng lẫn tím, đài hoa tách biệt ở cuối, có răng nhỏ ở mép

1.1.4 Giá trị dinh dưỡng

Ớt rất giàu protein, lipid, carbohydrate, chất xơ, muối khoáng (Ca, P, Fe) và các vitamin A, D3, E, C, K, B2 và B12 (El-Ghoraba et al 2013) Các hợp chất phytochemical trong ớt có quan hệ mật thiết đến sức khỏe chẳng hạn như acid ascorbic (Vitamin C), carotenoids (Provitamin A), tocopherols (Vitamin E), flavonoid và capsaicinoids rất quan trọng trong việc ngăn ngừa các bệnh mãn tính như ung thư, hen suyễn, ho, viêm họng, đau răng, tiểu đường và các bệnh tim mạch (El-Ghoraba AH, 2013) (Wahyuni Y, 2013)

Ngoài ra ớt còn có đặc tính chống oxy hóa, chống đột biến gen, giảm cholesterol trong máu ức chế miễn dịch (El-Ghoraba AH, 2013) đồng

thời ức chế sự phát triển của vi khuẩn và kết tụ tiểu cầu (Wahyuni Y, 2013)

Bảng 1.1: Thành phần các chất có trong 100 gram phần ăn được của Ớt (Đặng Thanh Tuấn, 2012)

1.2 Bệnh thán thư trên cây ớt

1.2.1 Giới thiệu chung

Bệnh thán thư (Anthracnose) có nguồn gốc từ tiếng Hy lạp có nghĩa “coal”, biểu hiện đặc điểm vết bệnh có màu tối như than, vết bệnh lõm xuống xuất hiện các vòng đồng tâm, có chứa các khối bào tử (Isaac S, 1992)

Bệnh thán thư trên ớt lần đầu tiên được báo cáo tại New Jersey Hoa Kỳ bởi (Halsted BD, 1890) đã mô tả các tác nhân gây bệnh là

Gloeopsorium piperatum và Colletotrichum nigrum Bệnh có thể gây hại

trên diện rộng trước và sau khi thu hoạch chúng cũng có thể là mầm bệnh

tiềm ẩn vì đôi khi chúng không phát triển cho đến khi quả chín Bệnh có thể gây hại trên lá, thân trái trước và sau thu hoạch (Isaac S, 1992)

Bệnh thán thư trên ớt đã được nghiên cứu là do nấm Colletotrichum spp gây ra bao gồm nấm C acutatum (Simmonds), C capsici (Syd.) Butler và Bisby, C gloeosporioides (Penz.) (Momol, 2006)

Nhiệt độ và các yếu tố khác chẳng hạn như độ ẩm bề mặt lá, độ ẩm, ánh sáng hoặc hệ vi sinh vật cạnh tranh (Royle DJ, Butler DR, 1986) thưởng ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ sinh trưởng của nấm Bề mặt ẩm ướt ảnh hưởng trực tiếp nhất đến sự nảy mầm, lây nhiễm và phát triển của mầm bệnh trên vật chủ Nói chung sự xâm nhiễm xảy ra trong nhiệt độ ấm, ẩm ướt Nhiệt độ khoảng 27 °C và độ ẩm cao (trung bình là 80 %) là tối ưu cho sự phát triển của bệnh thán thư (Roberts PD, 2001)

1.2.2 Phân loại

Giới: Fungi

Ngành: Asmycota

Ngành phụ: Pezizomycotina Lớp: Sordariomycetes

Colletotrichum truncatum

1.2.3 Triệu chứng bệnh thán thư do nấm Colletotrichum sp gây ra

Bệnh thán thư có thể gây hại trên lá, thân và trái còn non hoặc trái trưởng thành

Triệu chứng điển hình trên quả là các vết bệnh lõm hình tròn hoặc hình thoi, với các vòng tròn đồng tâm trên quả thường ẩm ướt và tạo ra các khối bào tử màu hồng đến cam, ranh giới giữa các mô bệnh là một đường đen chạy dọc theo vết bệnh sau 2-3 ngày kích thước vết bệnh có thể lên đến 1 cm Trên bề mặt vết bệnh có những chấm nhỏ màu đen là đĩa cành của nấm bệnh Các vết bệnh có thể liên kết với nhau làm quả bị thối, vỏ khô có màu trắng vàng bần (QCVN 01 - 138:2013/BNNPTNT)

Triệu chứng bệnh trên lá ban đầu là các đốm tròn màu xám, sau đó dần lên thành các đốm màu nâu, khô, hình tròn hoặc bầu dục (QCVN 01- 138:2013/BNNPTNT)

1.2.4 Cơ chế gây bệnh thán thư do vi nấm Colletotrichum sp 1.2.4.1 Chu kì gây bệnh thán thư của vi nấm Colletotrichum sp

Colletotrichum sp có thể tồn tại ở dạng bào tử đính và quả thể của

nấm Nấm có thể tồn tại qua mùa đông nhờ vào các cây kí chủ thuộc họ cà hoặc cây họ đậu khác nhau, các tàn dư sau thu hoạch, hay các cây nhiễm bệnh còn sót lại trên đồng ruộng khi ở trạng thái ngủ Các bào tử có thể ở trạng thái ngủ khi ở mùa đông, ở điều kiện không thuận lợi và

B

Hình 1.2 Colletotrichum sp gây bệnh trên quả (A), Colletotrichum sp

gây bệnh trên lá (B)

hoặc nước mưa sẽ làm bào tử nấm xâm nhiễm và lây lan từ cây này sang cây khác, người canh tác hay dụng cụ lao động cũng có thể lây mầm bệnh cho cây (Roberts PD, 2001)

1.2.4.2 Cơ chế gây bệnh của vi nấm Colletotrichum sp

Theo (Than PP, 2008) các loài Colletotrichum sp sử dụng các cách

khác nhau cho sự xâm nhiễm các mô chủ, mà thay đổi từ bán ký sinh nội bào đến hoại dưỡng ở vách dưới biểu bì (Bailey JA, 1992) Loài

Colletotrichum sp sản xuất một loạt các cấu trúc xâm nhiễm chuyển hóa

như đĩa áp và vòi xâm nhiễm, khuẩn ty nấm sơ cấp và khuẩn ty nấm hoại dưỡng thứ cấp (Perfect SE, 1999) Giai đoạn trước xâm nhiễm của cả hai rất giống nhau, trong đó bào tử bám chặt vào và nẩy mầm trên bề mặt cây trồng, tạo ra đĩa áp và hình thành vòi xâm nhiễm sau đó xâm nhiễm vào các lớp biểu bì (Bailey JA, 1992) Sau khi xâm nhiễm, các mầm bệnh ở trong vùng vách bên dưới lớp biểu bì sống hoại dưỡng và nhanh chóng

Hình 1.3 Chu kì gây bệnh của vi nấm Colletotrichum sp

phát hiện trong hình thức hoại sinh Ngược lại, các mầm bệnh thán thư cho thấy sự xâm nhiễm dinh dưỡng hoại sinh và sống bằng cách ký sinh vào các màng sinh chất và thành tế bào trong tế bào Sau khi ký sinh, khuẩn ty nấm trong tế bào sống ở trong một hoặc hai tế bào và sau đó sản sinh khuẩn ty nấm hoại dưỡng thứ cấp (Bailey JA, 1992) Do đó, các tác nhân gây bệnh được coi là bán ký sinh hoặc hoại dưỡng (Kim KK, 2004) Chỉ có một vài nghiên cứu chi tiết về cơ chế xâm nhiễm của nhiều loài

Colletotrichum sp trên ớt (Kim KK, 2004) nhận thấy rằng nhiễm hoại

sinh được tìm thấy trong quá trình lây nhiễm của C gloeosporioides trong

ớt (C annuum cv Jejujaerae) Biểu bì tế bào chất của cấy chủ trở nên cô

đặc và nhỏ không bào tăng lên và phá hủy tế bào đến các tế bào biểu bì của thực vật trong đó có thể bị phá hủy bởi các enzymee của mầm bệnh Ở các giai đoạn sau của bệnh, các mô đã bị xâm chiếm ở giữa và trong các tế bào bở các mầm bệnh Đặc điểm cấu trúc này chỉ ra rằng xâm nhiễm bị chi phối bởi sự tăng trưởng nấm hoại sinh

Hình 1.4 Cơ chế xâm nhiễm của vi nấm Colletotrichum sp.vào tế

bào ớt

Cu: Biểu bì N: Hoại sinh

PP: Hình thành vòi xâm nhiễm SH: Sợi nấm thứ cấp ILS: Đốm sáng (Internal Light Spot) ScH: Dưới lớp biểu bì PH: Sợi nấm sơ cấp

Bào tử (C) mọc mầm và hình thành đĩa áp (A), đĩa áp hình thành vòi xâm nhiễm (PP) xâm nhập qua lớp biểu bì (Cu) của tế bào chủ và trên đĩa áp xuất hiện đốm màu sáng (ILS)

Ở hình 1.4 (A), với cách xâm nhiễm bán ký sinh, vòi xâm nhiễm xuyên qua tế bào biểu bì của tế bào chủ và phồng to lên tạo ra khoang xâm nhiễm với sợi nấm có kích thước lớn, được gọi là sợi nấm thứ cấp (PH) Sợi nấm này có thể định vị và lan sang các mô biểu bì (E) và tế bào thịt lá (M) kế bên Trong giai đoạn đầu của sự xâm nhiễm này, sự tương tác giữa ký chủ và mầm bệnh là ký sinh bắt buộc Tiếp theo là giai đoạn hoại sinh (N), sự tương tác được thể hiện qua sự hình thành sợi nấm thứ cấp (SH) Các sợi nấm thứ cấp này đâm xuyên vào trong tế bào và len lõi vào các ngã gian bào đồng thời tiết enzyme phân hủy vách tế bào và giết chết tế bào chủ

Ở hình 1.4 (B), là cách xâm nhiễm hoại sinh, sự định cư bên dưới tế bào ký chủ bắt đầu ở bên dưới biểu bì (ScH) và thường không có giai đoạn ký sinh của sợi nấm bên trong vách hoặc nếu có thì giai đoạn này rất ngắn Nấm lây lan nhanh chóng qua các mô, đi vào trong tế bào và qua các gian bào (Dieguez-Uribeondo, 2004)

Phần lớn Bacillus sp là vi khuẩn hình que hay hình trực, đầu tròn hoặc

vuông, kích thước từ 0,5-1,2 x 2,5 – 10 µm, ở dạng đơn lẻ hay chuỗi ngắn

hoặc dài Đối với Bacillus sp có nội bào tử thì bào tử hình trụ, oval, tròn

hoặc bầu dục Tùy loài, bào tử có thể nằm ở giữa, gần cuối hoặc cuối, túi bào tử phồng hoặc không phồng Sự tạo thành nội bào tử được chấp nhận như là một đặc tính cơ bản để phân loại và xác định các thành viên của chi,

nhờ các nghiên cứu về B subtilis của Cohn, trong các nghiên cứu về các loài gây bệnh như B anthracis năm 1976 của Knok

Hầu hết các loài Bacillus sp đều di động ngoại trừ B anthracis và B mycoides mặc dù có sự khác biệt về khả năng di động của mỗi loài nhưng

đa số các loài đều có phản ứng catalase dương tính

1.3.3 Đặc điểm nuôi cấy

Bacillus sp là vi khuẩn hiếu khí và sinh vật hóa dị dưỡng linh hoạt có

khả năng hô hấp trong khi sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ đơn giản (đường,

amino acid, acid hữu cơ) Ngoài ra, còn có một số loài vi khuẩn Bacillus sp

là dị dưỡng nitơ, khử nitơ, cố định nitơ, kết tủa sắt, oxy hóa selenium, chất oxy hóa, giảm thiểu mangan, dinh dưỡng hóa năng vô cơ tùy ý, ưa acid, ưa

khuẩn lạc đặc trưng sau khi nuôi cấy 37 0C/ 24h Tuy nhiên, cũng có những loài ưa nhiệt chỉ có thể phát triển ở nhiệt độ từ 550C- 700C (B stearothermophilus) B.coagulans là loài ưa nhiệt trung bình, phát triển tốt

tại 45 - 55 0C B.larvae, B.popilliae phát triển ở 25 - 300C, có pH rộng từ 11 (Toure Y., 2004)

2-1.3.4 Ứng dụng của Bacillus sp

Bacillus sp được ứng dụng nhiều trong y khoa, dược phẩm, nông

nghiệp, công nghiệp môi trường nhờ tận dụng các lợi thế về đặc điểm sinh lý của chúng để sản xuất các kháng sinh như: Bacitracin và polymycin là hai

kháng sinh nổi tiếng thu được từ vi khuẩn Bacillus sp., surfactin vừa có hoạt

tính kháng khuẩn vừa có tính diện hoạt mạnh, subtilin có hoạt tính kháng khuẩn, kháng khối u, (Hong H A., 2005)

Trong nghiên cứu của (Sung-Jin Park, 2012), báo cáo sự lắng đọng sinh

học của Bacillus subtilis 168 và khả năng tăng cường độ bền của vật liệu xi măng B subtilis 168 đã được áp dụng trên bề mặt của các mẫu xi măng Kết

quả cho thấy một lớp hỗn hợp hữu cơ-vô cơ mới lắng đọng trên bề mặt của

hồ xi măng Ngoài ra, độ thấm nước của hồ xi măng được xử lý bằng B subtilis 168 thấp hơn so với các mẫu không được xử lý Hơn nữa, các vết

nứt nhân tạo trên hồ xi măng đã được khắc phục hoàn toàn nhờ sự lắng đọng

sinh học của B subtilis 168 Cường độ nén của vữa xi măng được xử lý bằng B subtilis 168 tăng khoảng 19,5 % khi so sánh với các mẫu hoàn thành

chỉ với môi trường B4 Tổng hợp lại, những phát hiện này cho thấy rằng sự

lắng đọng sinh học của B subtilis 168 có thể được sử dụng như một chất

làm kín và phủ để cải thiện cường độ và khả năng chống thấm nước của bê

tông Đây là bài báo đầu tiên báo cáo ứng dụng của Bacillus subtilis 168 về

khả năng cải thiện độ bền của vữa xi măng thông qua kết tủa canxi cacbonat

Bacillus megaterium có họat tính kháng nấm bệnh Phytophthora capsici, Pythium, Rhizotocnia mạnh do sản sinh một số hoạt chất kháng

phần của thuốc trừ sâu Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis sp làm

chế phẩm Israelensisserotype H14 diệt lăng quăng Các bào tử của

B.stearothermophilus được sử dụng để kiểm tra khử trùng nhiệt và B.subtilis sp với khả năng chịu nhiệt, hóa chất và bức xạ được sử dụng rộng

rãi để xác nhận việc khử trùng và khử trùng thay thế

Nghiên cứu và sản xuất chế phẩm sinh học từ Bacillus có tiềm năng

trong việc đóng góp vào sự phát triển của việc nuôi cá bằng cách duy trì sức khỏe của cá nuôi giúp cá tăng trưởng, phân giải thức ăn, đáp ứng miễn dịch, bảo vệ chống lại các bệnh nhiễm trùng, đặc biệt là chống lại các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn cũng như cải thiện chất lượng nước (Kuebutornye, 2019)

Van Frankenhuyzem đã nghiên cứu về việc sử dụng Bacillus thuringiensis để kiếm soát sâu chồi vân sam một loài sâu làm rụng lá của cây Kim tại Bắc Mỹ Sau khi sử dụng chế phẩm sinh học từ Bacillus thuringiensis đã kiểm soát sinh học được sâu chồi vân sam (Van

Frankenhuyzen, 2000)

Năm 2015, Mujal và cộng sự công bố chủng vi khuẩn nội sinh phân lập

từ rễ hồ tiêu Bacillus megaterium có hoạt tính kháng nấm bệnh Phytophthora capsici, Pythium, Rhizotocnia mạnh do sản sinh một số hợp

chất kháng nấm Aravildet al., (2009, 2010), đã phân lập 71 chủng vi khuẩn nội sinh trong rễ và thân cây hồ tiêu và tuyển chọn được 3 chủng có khả

năng ức chế nấm thối rễ hồ tiêu Phytophthora capsici tới 70 % trong điều

kiện phòng thí nghiệm và mô hình trong nhà lưới (Munjal, 2015)

Nguyễn Ngọc Mỹ (2012) đã phân lập được 30 chủng vi khuẩn cố định

đạm nội sinh trong rễ và tuyển chọn được chủng B cereus M15 là chủng có

hoạt tính cố định N và phân giải P cao nhất Hàm lượng N và P trong lá cây

của cây cà phê chè giai đoạn vườn ươm như: chiều cao cây, đường kính gốc, chiều dài lá và diện tích lá cũng đều tăng so với đối chứng (Mỹ, 2012)

1.4 Bacillus sp và chất chuyển hóa kháng nấm của Bacillus sp

Hiện nay, có rất nhiều chất kháng nấm là các sản phẩm chuyển hóa của

Bacillus Các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm đã được khai

thác trong y học và ngành công nghiệp Đồng thời các chất kháng nấm này thường sử dụng để phòng chống và kiểm soát bệnh trên cây như một tác nhân kiểm soát sinh học Các hợp chấtt này thường là enzyme thủy phân hay là các peptid có hoạt tính sinh học, hoặc các hợp chất polyketide (Zhang T và cs, 2008; Kumar A và cs, 2009)

Enzyme: Bacillus có khả năng sản xuất nhiều loại enzyme phân hủy

thành tế bào nấm như chitinase, protease, glucanase… Các enzyme này phá

hủy thành tế bào của nấm, đặc biệt là chitinase Nhiều chủng Bacillus có thể

sản xuất enzyme chitinase ở mức cao do đó làm gia tăng khả năng kháng nấm

Các peptide: dựa vào đặc điểm cấu trúc của peptid, nó có thể được phân

thành 3 loại: cyclic lipopeptide (CLP), phosphono-oligopeptide và

dipeptide

+ Fengycin là lipopeptide vòng có hoạt tính đối kháng mạnh với nấm

Fengycin được tổng hợp nhiều trong pha tăng trưởng và đạt nồng độ cực đại ở cuối pha tăng trưởng, fengycin vẫn được duy trì ở nồng độ thấp với hàm lượng ổn định trong pha cân bằng (Tsuey-Pin Lin,1999)

+ Mycosubtilin là lipopeptide có tính kháng sinh thuộc họ iturin Các

lipopeptide thuộc họ iturin có tính đối kháng mạnh với nấm nhưng có tác động rất hạn chế với vi khuẩn (Erwin H Duitman,1999)

+ Bacilysocin là phospholipid có tính kháng khuẩn mạnh đối với

nấm, được tổng hợp khi bắt đầu pha cân bằng sau đó thì giảm dần Bacilysocin là kháng sinh có bản chất phospholipid được phát hiện đầu tiên trên Bacillus subtilis Cấu trúc của bacilysocin là 1-(12-

hợp từ tiền chất là phosphatidylglycerol, là một phospholipid chủ yếu của

Bacillus subtilis Quá trình chuyển phosphatidylglycerol thành bacilysocin

được thực hiện bởi enzymee lysophospholypase được mã hóa bởi gene ytpA (Norimasa Tamehiro, 2002)

1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước của Bacillus sp kháng

nấm bệnh thán thư

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trần Thùy Trang đã tiến hành phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn

thuộc nhóm Bacillus subtilis có khả năng đối kháng tốt với nấm Colletotrichum scovillei gây bệnh thán thư trên ớt ở Thành phố Hồ Chí

Minh Sau khi thu thập được 5 mẫu đất, nghiên cứu này đã phân lập được

22 chủng nghi ngờ thuộc nhóm Bacillus subtilis Trong đó, chủng vi khuẩn BHCM8.3 có khả năng đối kháng mạnh nhất với nấm Colletotrichum scovillei trên đĩa Petri (hiệu quả đối kháng là 81,58 % sau 15 ngày khảo sát)

(Trần Thùy Trang, 2020)

Bệnh khô cành cây cà phê là một trong những bệnh hại quan trọng tại Đắk Nông Nghiên cứu này cho thấy kết quả phân lập 55 mẫu cà phê ở tỉnh Đắk Nông có 3 nhóm nấm chính gây bệnh khô cành khô quả, trong đó nhóm

Colletotrichum CC1.5 có khả năng gây bệnh nhanh và mạnh Trong 21 chủng Bacillus sp phân lập ở đất rừng nguyên sinh và đất vườn cà phê khỏe mạnh tại Đắk-Nông, chủng Bacillus subtilis ĐR2B1 có khả năng đối kháng tốt với Colletotrichum CC1.5 ở phương pháp đối kháng trực tiếp 67,41 %

và đối kháng khuếch tán qua lỗ thạch 24,67 mm sau 6 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA Nghiên cứu này góp phần cung cấp thêm thông tin về sử

dụng vi khuẩn đối kháng trong phòng chống nấm Colletotrichum gây bệnh

khô cành khô quả cây cà phê (Nguyễn Bá Thọ, 2020)

1.5.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

thấy trong xét nghiệm đối kháng Quan sát bằng kính hiển vi cho thấy sự phân giải sợi nấm rõ ràng và sự thoái hóa của thành tế bào nấm Trong nuôi

cấy đối kháng dạng lỏng, chủng B subtilis ức chế C Gloeosporioides lên

đến 100 % (N Ashwini, 2013)

Bacillus subtilis YJH-051 được phân lập từ ruộng trồng tiêu được thử nghiệm để kiểm soát sinh học cho thấy có khả năng ức chế đối với nấm C gloeosporioides và ngăn chặn bệnh thán thư trên ớt Rất nhiều Bacillus subtilis có thể kiểm soát sinh học đã được xác định và sử dụng trên thế giới, Bacillus subtilis YJH-051 có tiềm năng phát triển như một chất kiểm soát sinh học có sẵn trên thị trường để bảo vệ ớt đối với bệnh thán thư do C gloeosporioides gây ra (Yoo, 2009)

Phân lập Bacillus subtilis từ quả và hạt ớt đã ức chế sự phát triển in vitro và sự nảy mầm của bào tử nấm Colletotrichum capsici và Colletotrichum gloeosporioides, tác nhân gây bệnh thán thư trên ớt Trên môi trường thạch

khoai tây, vi khuẩn gây ra sự ức chế 64,6 % và 67,2 % đối với sự phát triển

sợi nấm của C capsici và C gloeosporioides tương ứng Sự ức chế hoàn

toàn trong sự nảy mầm của bào tử đã được ghi nhận đối với cả hai loại nấm khi có sự hiện diện của vi khuẩn trong 24 giờ sau khi nuối cấy Dịch lọc

nuôi cấy trong nước của B subtilis cũng ức chế sự phát triển và nảy mầm của Colletotrichum spp., (Meon, 1994)

PHẦN II:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

chủng vi khuẩn Bacillus sp với vi nấm Colletotrichum sp

Gây bệnh nhân tạo vi nấm

Colletotrichum sp lên quả

khuẩn Bacillus sp

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

2.2 Vật liệu nghiên cứu

- Bộ sưu tập 7 chủng vi khuẩn Bacillus sp KT2, Bacillus polyfermenticus F27, Bacillus sp TS3, Bacillus amyloliquefaciens T3, Bacillus subtilis Q111, Bacillus sp PH3, Bacillus subtilis S29 có tiềm năng được cung cấp bởi

phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh

- Mẫu ớt bệnh được thu thập tại thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng

2.3 Thiết bị, dụng cụ, môi trường

2.3.1 Thiết bị

- Tủ cấy vô trùng - Nồi hấp

- Cân phân tích - Máy lắc - Tủ sấy - Tủ lạnh - Kính hiển vi - Tủ ấm - Cân kỹ thuật - Lò vi sóng - Máy li tâm

2.3.2 Dụng cụ

- Ống nghiệm - Đĩa petri - Lame - Ống đong - Đũa thủy tinh

- Eppendorf - Bình serum - Đầu tuýp - Bông Thấm - Bông không thấm - Bình schott - Bộ lọc - Ống falcon - Tăm bông

- Màng lọc 0,2 µm - Giấy lọc 25 µm

2.3.3 Môi trường, hóa chất và thuốc nhuộm

- Thuốc nhuộm Crystal violet, Safranin O, Lugol, Lactophenol

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phân lập nấm gây bệnh thán thư Colletotrichum sp

Thu nhận mẫu bệnh:

Bệnh có thể hại thân, lá, quả và hạt, nhưng hại chủ yếu trên quả vào giai đoạn chín Triệu chứng bệnh trên lá ban đầu là các đốm tròn màu xám, sau đó lớn dần lên thành các đốm màu nâu, khô, hình tròn hoặc bầu dục Vết bệnh phát triển lớn lên và liên kết nhau làm khô cháy một mảng lá làm lá úa vàng và rụng Triệu chứng trên trái ban đầu là một đốm nhỏ, hơi lõm, ướt trên bề mặt vỏ quả, sau 2-3 ngày kích thước vết bệnh có thể lên tới 1cm đường kính Vết bệnh thường có hình thoi, lõm, phân ranh giới giữa mô bệnh là một đường màu đen chạy dọc theo vết

bệnh Trên bề mặt vết bệnh có những chấm nhỏ là đĩa cành của nấm bệnh Các vết bệnh có thể liên kết với nhau làm quả bị thối, vỏ khô có màu trắng vàng bần (Lester W Burgess, 2009)

Xử lí mẫu và phân lập:

- Thu mẫu ớt có có biểu hiện bệnh thán thư

- Rửa sạch với nước để loại bỏ đất bụi và các tạp chất khác

- Khử trùng bề mặt quả bằng ethanol 70 % bằng cách nhúng nhanh quả ớt vào ethanol 70 % trong 5 giây

- Rửa lại bằng nước vô trùng và để khô trên giấy thấm vô trùng - Dùng dao đã khử trùng cắt những mẫu nhỏ (2 x 2 mm) từ phần ranh

giới giữa mô khỏe và mô bệnh - Đặt mẫu lên môi trường PDA

- Ủ đĩa cấy ở nhiệt độ 28 oC trong 7 ngày

- Sau 2-5 ngày, các tản nấm phát triển từ những mẫu ớt Lựa chọn những

khuẩn lạc có hình thái đặc trưng của chủng Colletotrichum sp ở giai đoạn

đầu là khuẩn lạc có màu ửng hồng ở tâm, sợi nấm phát triển sát dưới thạch agar, không bung sợi tơ lên như các dòng nấm khác

- Cấy truyền những khuẩn lạc đặc trưng (cắt ở mép ngoài tản nấm) sang môi trường PDA để tạo dòng thuần

- Khi nuôi từ ngày thứ 4 trở lên, khuẩn lạc nấm ban đầu có màu trắng, sẽ xuất hiện một số vết đen ở mặt dưới thạch, đây là dấu hiệu đặc trưng

của các loài Colletotrichum sp (Lester W Burgess, 2009) 2.4.2 Làm thuần

Để làm thuần nấm mốc tiến hành phương pháp cấy đơn bào tử trên môi trường PDA, ủ đĩa cấy ở nhiệt độ 28 oC trong vòng 7 ngày

2.4.3 Quan sát đại thể và vi thể các mẫu nấm bệnh thán thư phân lập được