thiết lập quy trình real time pcr phát hiện đậu phộng gây dị ứng trong các nguyên liệu sản xuất thực phẩm thương mại

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

THIẾT LẬP QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN ĐẬU PHỘNG GÂY DỊ ỨNG TRONG CÁC NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT

THỰC PHẨM THƯƠNG MẠI

KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: Y – DƯỢC

GVHD: ThS LAO ĐỨC THUẬN CBHD: NGUYỄN DUY KHÁNH SVTH: HÀ THỊ PHƯƠNG TRINH MSSV: 1553010220

Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

THIẾT LẬP QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN ĐẬU PHỘNG GÂY DỊ ỨNG TRONG CÁC N GUYÊN LIỆU SẢN XUẤT

THỰC PHẨM THƯƠNG MẠI

KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: Y DƯỢC

GVHD: ThS LAO ĐỨC THUẬN CBHD: NGUYỄN DUY KHÁNH SVTH: HÀ THỊ PHƯƠNG TRINH MSSV: 1553010220

Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2019

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy-Th.S Lao Đức Thuận, Anh Nguyễn Duy Khánh, người đã truyền cho em lòng nhiệt huyết trong nghiên cứu và học tập, giúp đỡ em giải quyết những vấn đề khó khăn trong quá trình thực hiện khóa luận Em cảm ơn Thầy và Anh đã góp ý, chỉnh sửa và giúp em hoàn thành báo cáo này

Em chân thành cảm ơn Anh Nguyễn Văn Hưng và các Anh Chị trong Công ty Cổ phần Công nghệ TBR đã cho phép và tạo điều kiện cho em được có cơ hội làm việc tại Công ty

Em cũng xin chân thành cảm ơn Cô-PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy, Cô-Th.S Trương Kim Phượng và các Thầy, Cô khoa Công Nghệ Sinh học trường đại học Mở Tp Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho em những kiến thức khoa học nền tảng và những kinh nghiệm, kỹ năng trong học tập, làm việc

Em cảm ơn các anh/chị, các bạn đang làm việc cũng như thực tập ở phòng Nghiên cứu của Công Ty Cổ phần Công nghệ TBR đã hết lòng giúp đỡ, chia sẻ, hỗ trợ và đồng hành cùng em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến gia đình, Ba Mẹ đã luôn yêu thương, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong suốt quá trình học tập

Tp Hồ Chí Minh, 15 tháng 05 năm 2019

Hà Thị Phương Trinh

1.1.1Phân loại khoa học 4

1.1.2Nguồn gốc, phân bố và công dụng của đậu phộng 4

1.4.3Các phương pháp nghiên cứu phát hiện đậu phộng 13

1.5PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR 15

1.5.1Định nghĩa 15

1.5.2Biểu đồ khuếch đại của real-time PCR 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

2.1.3.3 Hóa chất cho quá trình tách chiết: 20

2.1.3.4 Hóa chất cho quá trình real-time PCR và điện di 20

2.3.3Thí nghiệm 3: Khảo sát độ nhạy của toàn bộ quy trình trên mẫu nguyên liệu thực phẩm chứa đậu phộng 26

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO CẶP MỒI KHUẾCH ĐẠI GENE ARA H2 28

3.1.1Kết quả khảo sát các cặp mồi tham khảo: 28

3.1.1.1 Cặp mồi tham khảo: 28

3.1.1.2 Kết quả thông số vật lý cặp mồi Ara H2 28

3.1.1.3 Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi: 29

3.2CHU TRÌNH NHIỆT THAM KHẢO 30

38

3.3.2.2 Kết quả khảo sát quy trình trên các mẫu nguyên liệu thực phẩm 40

3.3.3Thí nghiệm 3: Khảo sát độ nhạy của toàn bộ quy trình trên mẫu nguyên liệu thực phẩm chứa đậu phộng 43

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

4.1KẾT LUẬN 504.2ĐỀ NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

Hình 3.5 Kết quả Annhyb của cặp mồi AraH2 29

Hình 3.6 Kết quả BLAST của mồi ARA H2 30

Hình 3.7 Chu trình nhiệt tham khảo 31

Hình 3.8 Kết quả Realtime PCR khuếch đại trình tự AraH2 mẫu đậu phộng, đậu nành, đậu xanh 32

Hình 3.9 Kết quả điện di trình tự DNA mẫu đậu phộng, đậu nành, đậu xanh 34 Hình 3.10 Kết quả Realtime PCR trình tự DNA đậu phộng với các nồng độ từ 200 – 600 nM 35

Hình 3.11 Kết quả Realtime PCR trình tự DNA đậu phộng được pha loãng 37

Hình 3.12 Kết quả Reatime PCR trình tự DNA mẫu đậu phông thô và đậu phộng đã qua chế biến 39

Hình 3.13 Kết quả Realtime PCR trình tự DNA các mẫu nguyên liệu thực phẩm tách chiết bằng các phương pháp khác nhau 42

Hình 3.14 Kết quả Realtime PCR trình tự DNA mẫu nguyên liệu thực phẩm có chứa đậu phộng 45

Hình 3.15 Kết quả Realtime PCR trình tự DNA mẫu nguyên liệu thực phẩm chứa đậu phộng được pha loãng 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần các acid amin trong đậu phộng 8Bảng 2.2 Các loại mẫu sử dụng cho nghiên cứu 20Bảng 3.3 Cặp mồi tham khảo từ nghiên cứu của Stephan và cộng sự (2004) 28Bảng 3.4 Kết quả thông số vật lý cặp mồi Ara H2 28Bảng 3.5 Kết quả chu kì ngưỡng Ct trình tự DNA mẫu đậu phộng, đậu nành, đậu xanh 33 Bảng 3.6 Kết quả chu kì ngưỡng Ct trình tự DNA đậu phộng với các nồng độ mồi từ 200 – 600 nM 36Bảng 3.7 Kết quả chu kì ngưỡng Ct trình tự DNA được pha loãng 38Bảng 3.8 Kết quả chu kì ngưỡng Ct trình tự DNA mẫu đậu phộng thô và đậu phộng đã qua chế biến 40Bảng 3.9 Kết quả đo OD nồng độ DNA sau khi tách chiết bằng phương pháp Phenol/Chloroform 41Bảng 3.10 Kết quả chu kì ngưỡng trình tự DNA các mẫu nguyên liệu thực phẩm tách chiết bằng các phương pháp khác nhau 43Bảng 3.11 Kết quả chu kì ngưỡng Ct trình tự DNA mẫu nguyên liệu thực phẩm có chứa đậu phộng 46Bảng 3.12 Kết quả chu kì ngưỡng Ct trình tự DNA mẫu nguyên liệu thực phẩm được pha loãng 48

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ARA H2 Arachis hypogaea allergen II DNA Deoxyribo nucleic acid

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dị ứng với thực phẩm hiện đang là một trong những vấn đề dinh dưỡng cấp thiết, bởi tất cả các thực phẩm có chứa protein đều có thể là tác nhân gây dị ứng Dị ứng thực phẩm thường gặp nhất là type I do immunoglobulin E xúc tác phản ứng mẫn cảm Biểu hiện lâm sàng của dị ứng thực phẩm khá đa dạng, từ nổi mày đay, ngứa ran, đau bụng, khó thở cho tới sốc phản vệ và có thể dẫn tới tử vong nếu không được cấp cứu kịp thời

Đặc biệt, đậu phộng là một vấn đề nghiêm trọng đối với các bệnh nhân dị ứng vì hai lý do: đầu tiên, một phần ba của tất cả các phản ứng dị ứng nghiêm trọng xuất hiện ở bệnh nhân dị ứng đậu phộng, thứ hai, lượng đậu phộng rất thấp cũng có thể kích hoạt các phản ứng dị ứng Trong những nghiên cứu này, khoảng 1 mg protein đậu phộng là đủ để xuất hiện các phản ứng nhẹ ở người dị ứng đậu phộng Các dấu hiệu của việc dị ứng đậu phộng rất đa dạng: nổi mề đay ở da, da bị ửng đỏ và sưng tấy; đường hô hấp có hiện tượng khó thở, thở khò khè; bụng chướng đau, tiêu chảy hoặc nôn mửa; nặng hơn, dị ứng đậu phộng có khả năng khiến người bệnh tụt huyết áp, nhịp tim không đều hoặc thậm chí ngừng đập Đậu phộng chứa nhiều protein khác nhau, mỗi loại có cấu trúc riêng biệt của nó Một số protein trong số này gây dị ứng, có khả năng kích hoạt các kháng thể IgE Các protein gây dị ứng đậu phộng cụ thể như: Ara H1, Ara H2, Ara H3, Ara H4, Ara H5, Ara H6, Ara H7, Ara 8, Ara Agglutinin, Ara HLTP, Ara Holeosin, Ara HT1 Trong đó, Ara H2 đã được công nhận là chất gây dị ứng mạnh trong tất cả các xét nghiệm về việc kích hoạt triệu chứng gây dị ứng và nó gây ra một phản ứng dị ứng ở nồng độ rất thấp, trong khi Ara H1 và Ara H3 thì gây phản ứng dị ứng ở mức độ yếu hơn và phản ứng chỉ xảy ra ở nồng độ cao hơn nhiều lần Ara H2 (Koppelman et al., 2004) Trong nghiên cứu của Hird và cộng

sự (2003), nhóm tác giả đã chỉ ra rằng, gen Ara H2 mã hóa cho protein Ara H2 và dễ

dàng được tìm thấy trong đậu phộng

Cho đến nay, cách duy nhất để người tiêu dùng bị dị ứng đậu phộng tránh các phản ứng dị ứng là tránh sử dụng các loại thực phẩm chứa đậu phộng một cách nghiêm ngặt Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy rằng việc vô tình ăn phải thực phẩm chứa đậu phộng hoặc các chất gây dị ứng trong thực phẩm vẫn rất phổ biến Sự nhiễm

các chất gây dị ứng ẩn có thể xảy ra do quá trình làm sạch thiết bị sản xuất không đạt, do sử dụng nguyên liệu nhiễm bẩn hoặc do nhãn không được ghi đầy đủ và chính xác Đặc biệt, theo số liệu thống kê từ Tổng cục hải quan cho biết, kim ngạch xuất khẩu bánh kẹo và các sản phẩm từ ngũ cốc của Việt Nam từ đầu năm đến hết tháng 7/2018 đạt 359,4 triệu USD Bánh kẹo và các sản phẩm từ ngũ cốc của Việt Nam được xuất khẩu chủ yếu sang các thị trường Trung Quốc, Mỹ, Hàn Quốc, Đức, Úc, Do đó, việc phát triển các phương pháp phân tích để phát hiện các chất gây dị ứng là cần thiết để giám sát việc thực hiện dán nhãn trên các sản phẩm theo đúng yêu cầu được quy định, nhằm bảo vệ người tiêu dùng khỏi các chất gây dị ứng ẩn và hỗ trợ các nhà sản xuất thiết lập các khái niệm về hệ thống Phân tích mối nguy và điểm kiểm soát tới hạn (HACCPs), kiểm soát các nguy cơ nhiễm Đối với việc phát hiện sự có mặt đậu phộng, các nghiên cứu gần đây đã phát triển phương pháp real-time PCR, là một phương pháp có thể áp dụng cho mục đích định lượng Ưu điểm chính của việc sử dụng real-time PCR cho mục đích này là độ đặc hiệu cao, có thể được sử dụng là phương pháp bán định lượng để phát hiện sự hiện diện của đậu phộng Do đó, khảo sát và xây dựng quy trình phát hiện các chất gây dị ứng ở đậu phộng bằng kỹ thuật realtime-PCR là cần thiết

Hiện nay, chưa thấy các nghiên cứu được công bố về việc phát triển các

phương pháp phân tích để phát hiện đậu phộng ở Việt Nam Vì vậy, đề tài: “XÂY

DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN ĐẬU PHỘNG GÂY DỊ ỨNG TRONG CÁC NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM THƯƠNG MẠI.” được thực hiện dựa trên nền tảng kế thừa những nghiên cứu trước, nhằm xây

dựng và phát triển một phương pháp phát hiện đậu phộng trong các sản phẩm thực

phẩm thương mại, gây ảnh hưởng đến bệnh nhân dị ứng đậu phộng

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐẬU PHỘNG

1.1.1 Phân loại khoa học

Tên khoa học: Arachis hypogaea L Giới (Regume): Plantae

Bộ (ordo): Fabales Họ (Familia): Fabaceae

Phân họ (subfamilia): Faboideae Tông (tribus): Aeschynomeneae Chi (Genus): Arachis

Loài (Species): Arachis hypogaea

1.1.2 Nguồn gốc, phân bố và công dụng của đậu phộng

1.1.2.1 Nguồn gốc, phân bố

Đậu phộng hay còn gọi là lạc, là cây thực phẩm thuộc họ Đậu có nguồn gốc tại Nam Mỹ (phía nam Bolivia / phía tây bắc Argentina, được phát hiện lần đầu tiên vào khoảng năm 1000 TCN Đậu phộng được trồng phổ biến sang châu Phi, châu Á, châu Âu và quần đảo Thái Bình Dương khoảng vào thế kỷ 16 và 17 với các chuyến đi khám phá của Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Anh và Hà Lan (Krapovickas, 1969, 1973; Gregort và cộng sự, 1980, 1982; Isleib và cộng sự, 1994) Cây đậu phộng được biết đến ở Trung Quốc và các nước ở Tây Thái Bình Dương như Indonesia, Madagascar nhờ thương nhân người Bồ Đào Nha vào thế kỷ 17 và một loạt các nhà truyền giáo người Mỹ trong thế kỷ 19 và sau đó lan rộng khắp châu Á [1] Ở Việt Nam, lịch sử trồng cây đậu phộng chưa được xác minh rõ ràng, theo kỹ sư Hồ Đình Hải, đậu phộng từ Trung Quốc có thể du nhập vào nước ta khoảng thế kỷ 17-18

Ngày nay, đậu phộng được trồng ở 108 quốc gia với khoảng 22,2 triệu ha Trong đó có 13,69 triệu ha là ở châu Á (Ấn Độ 8 triệu ha; Trung Quốc 3,84 triệu ha), 7,39 triệu ha ở châu Phi, vùng cận Sahara và 0,7 triệu ha ở Trung và Nam Mỹ Sản lượng trung bình trên quy mô toàn cầu tăng nhẹ từ 1,08 Mt ha-1 trong những năm 1980 lên 1,15 Mt ha-1 vào những năm 1990 (Carley và Fletcher, 1995), và sản lượng toàn cầu là 29 triệu tấn quả Theo thống kê của tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp Quốc (FAO), Ấn Độ, Trung Quốc và Hoa

Kỳ là những nước đứng đầu về sản xuất và trồng trọt đậu phộng, chiếm khoảng 70% diện tích trồng của thế giới (FAO, 1995-2001) [1]

1.1.2.2 Công dụng

Công dụng của đậu phộng rất đa dạng, tất cả các bộ phận của cây đều có thể được sử dụng Hạt đậu phộng có thể dùng làm thực phẩm trực tiếp khi luộc hoặc rang, ngoài ra được sử dụng trong các loại món ăn, bánh kẹo nhờ vị thơm và béo của hạt Dầu từ đậu phộng không chỉ được sử dụng cho nấu ăn, sản xuất bơ thực vật, mà còn được sử dụng trong công nghiệp như sản xuất các loại xà phòng trong dân dụng và y tế, là nguồn nhiên liệu cho các động cơ diesel Đậu phộng sau khi ép dầu, phần bã hay còn gọi là bánh dầu vẫn còn chứa một phần chất béo và protein rất cao, được dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc Lá và thân cây động phộng giàu nguồn protein và hydrate carbon nên được dùng làm thức ăn tươi hoặc ủ chua cho động vật nhai lại rất tốt Phần vỏ của hạt có thể được sử dụng làm nhiên liệu đốt, làm chất độn cho đất, như một nguồn hóa chất hữu cơ thô Cây đậu phộng có chứa các vi khuẩn cộng sinh tên là Rhizobia, nằm trong các nốt sần của rễ, có khả năng cố định đạm, cung cấp trực tiếp lượng đạm cho cây vừa có tác dụng bổ sung lượng đạm cho vi sinh vật đất (Hồ Đình Hải, 2014)

Các bộ phận từ cây đậu phộng được sử dụng trong cả Đông Y và Tây Y Theo đông y, hạt đậu phộng có vị ngọt, béo và bùi, có tác dụng bổ tỳ, dưỡng vị, nhuận phế, lợi tràng, tiêu đờm, điều hòa khí huyết, tiêu sưng, cầm máu, lợi tiểu, tăng tiết sữa, mát họng, giảm cholesterol, chống lão hóa Theo các nghiên cứu của y học hiện đại, dược tính từ các bộ phận của đậu phộng như acid folic, mangan, amino acid trytophan, vitamin B3, có khả năng giảm nguy cơ sinh con dị tật, ổn định đường huyết, ngăn ngừa sỏi mật, phòng chống trầm cảm, tăng cường trí nhớ, giảm cholesterol, bảo vệ tim mạch, (Hồ Đình Hải, 2014)

Tuy nhiên, cũng có một số cảnh báo nguy hiểm đối với người sử dụng đậu phộng Độc tố aflatioxin sinh ra khi đậu phộng nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus có khả năng gây ngộ độc thực phẩm trực tiếp và là chất gây ung thư Ngoài ra, hệ miễn dịch của cơ thể một số người có phản ứng quá mẫn đối với

các protein chứa trong đậu phộng, gây nên các triệu chứng thể chất nghiêm trọng,.(Hồ Đình Hải, 2014)

1.2.1 Đặc điểm

Đậu phộng là cây thân thảo, thân có thể là thân đứng hoặc thân bò Chiều cao thân khoảng 30-40 cm Thân mọc thẳng, thân non hình tròn, nhưng phần thân mang cành là thân rỗng khi cây ra hoa Thân có 15 - 25 đốt, phần thân gần gốc có đốt ngắn, phần giữa và phía trên thân đốt dài hơn Thân thường có màu xanh hoặc đỏ tím, có lông tơ

Hình 1.1 Cây đậu phộng [2]

Đậu phộng là cây hai lá mầm Lá mọc xen kẽ, là loại lá kép hình lông chim với bốn lá chét, kích thước lá chét dài 18-40 mm và rộng 15-25 mm Lá thường hình bầu dục dài hoặc hình trứng lộn ngược

Hoa lưỡng tính, thường mọc thành chùm, có 6-7 cái Hoa màu vàng hoặc trắng, cuống hoa dài 2-4 cm, gồm 5 bộ phận: lá bắc, lá đài, tràng hoa, nhị đực,

nhụy cái Sau khi thụ phấn, tia củ phát triển dài ra và chui xuống đất, dài 3-7 cm Tia củ ở trên không có màu tím, sau khi xuống đất có màu trắng

Tia củ do mô phân sinh ở gốc bầu hoa hình thành, sau khi thụ tinh, tia củ phát triển đẩy bầu hoa xuống đất Lúc này, quả bắt đầu hình thành và phát triển ở độ sâu 2-7 cm dưới mặt đất Tia củ có cấu tạo như lông hút, nhờ vậy có thể hút được các chất dinh dưỡng như rễ

Quả bao gồm vỏ hạt và 1-4 hạt Vỏ quả gồm có 3 tầng: tầng ngoại bì, tầng trung bì và tầng nội bì Tầng ngoại và tầng trung bì gồm những tế bào cứng, tầng nội bì gồm những tế bào mềm Độ lớn của quả dao động từ 10x5 mm đến 80x12 mm, bề dày của quả biến động từ 0,2-2 mm Số quả trên một cây có thể thay đổi tùy giống và điều kiện trồng trọt

Hạt đậu phộng gồm vỏ lụa bao bọc bên ngoài và phôi với hai lá mầm Hình dạng của hạt có thể là hình tròn, bầu dục dài hoặc ngắn, có rảnh dọc Lượng dầu trong hạt có thể lên đến 50% [2]

Hình 1.2 Cấu tạo hạt đậu phộng

1.2.2 Thành phần hóa học

1.2.2.1 Protein

Protein trong đậu phộng chiếm khoảng 21-36%, gồm hai loại Globulin chính, chiếm 90-95% trong các loại protein đậu phộng: Arachin (chiếm ¾) và Conarachin (chiếm ¼) [3]

Theo phân tích của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA), trong 100 g đậu phộng có các thành phần acid amin như sau:

1.2.2.3 Cacbonhydrate

Trong đậu phộng chứa 5% monosaccharide, bao gồm 2,9% D-glucose và 2,1% D-fructose Hàm lượng oligosaccharide khoảng 3,3%, bao gồm 0,9% sucrose, 1% raffinose, 0,8% stachyose và 0,3% verbascose (E.W., Lusas, 1979) Trong khi đó, polysaccharide trong đậu phộng chủ yếu gồm: tinh bột, glucan, galactoaraban, hemicellulose và cellulose [2]

1.2.2.4 Các thành phần khác

Acide phytic và muối phytate đóng vai trò là nguồn dự trữ phosphate, thường hiện diện trong lá mầm Bột đậu phộng sau khi tách béo chứa 1,5-1,7% phytate Mặc dù có những ý kiến lo ngại về sự hấp thụ phytate, nhưng một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng acide phytic đóng vai trò quan trọng trong việc làm giảm hàm lượng glucose trong máu, làm giảm hàm lượng cholesterol cũng như làm giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư (Shahidi, 1997)

Ngoài ra, trong đậu phộng còn có một hàm lượng đáng kể các hợp chất phenolic, bao gồm: acide phenolic (caffeic, vanillic, syringic, coumaric) hoặc tannins thường tồn tại ở dạng tự do, ester hoặc các dạng liên kết khác Các hợp chất phenolic có thể tác dụng với protein., gây ra mùi vị không mong muốn, làm sậm màu cũng như giảm giá trị của các khoáng chất [2]

Các nguyên tố khoáng có trong đậu phộng chủ yếu gồm K, P, Mg và Ca Còn có các loại vitamin B1, B2, B3, B5, B6, B9

1.2.3 Protein gây dị ứng trong đậu phộng

Đậu phộng chứa nhiều protein khác nhau, mỗi loại đều có cấu trúc riêng biệt Một số protein có khả năng gây dị ứng, có thể kích hoạt các kháng thể IgE, mỗi phân tử kháng thể được đặc hiệu với một chất gây dị ứng nhất định Các protein gây dị ứng bao gồm: Ara H1, Ara H2, Ara H3, Ara H4, Ara H5, Ara H6, Ara H7, Ara H8, Ara Agglutinin, Ara HLTP, Ara Holeosin, Ara HT1 [4]

Mỗi chất gây dị ứng sẽ ảnh hưởng và gây phản ứng dị ứng đến từng cá nhân một cách khác nhau Mỗi cá nhân sẽ mẫn cảm với một hoặc nhiều loại protein gây dị ứng và không có phản ứng với các loại protein còn lại Trong đó, protein gây dị ứng thường xuyên được phát hiện là nguyên nhân gây dị ứng đáng kể cho người là Ara H2 Trong nghiên cứu của Koppelman và cộng sự (2004), Ara

H2 đã được công nhận là chất gây dị ứng mạnh nhất trong tất cả các xét nghiệm về việc kích hoạt triệu chứng gây dị ứng Ara H2 gây một phản ứng dị ứng với nồng độ rất thấp, trong khi Ara H1 và Ara H3 thì gây phản ứng dị ứng ở mức độ nhẹ hơn và nồng độ của Ara H1 và Ara H3 cao gấp trăm lần Ara H2 thì phản ứng mới xảy ra Becker và cộng sự (2001) đã tính toán tỷ lệ mẫn cảm với các chất gây dị ứng trong 40 bệnh nhân mẫn cảm với đậu phộng Kết quả chỉ ra rằng, Ara H2 gây dị ứng ở 85% bệnh nhân, Ara H1 65%, Ara H4 53% là những chất gây dị uwsngc hính, còn Ara H5 (13%), Ara H6 (38%) và Ara H7 (43%) là những tác nhân gây dị ứng phụ

Scurlock và cộng sự (2004) cho rằng, sự kích thích phản ứng dị ứng của các protein trong đậu phộng có liên quan đến dân tộc và vùng miền Ngoài ra còn có sự ảnh hưởng của các phương pháp chế biến khác nhau trong sản xuất thực phẩm có đậu phộng Điều này có thể giải thích được tại sao một số vùng dân cư người dân có nguy cơ bị dị ứng cao hơn nhiều so với các vùng dân cư khác

1.3 BỆNH DỊ ỨNG THỰC PHẨM 1.3.1 Bệnh dị ứng

Dị ứng là một phản ứng rối loạn của cơ thể đối với một chất vô hại được gọi là chất gây dị ứng Chất gây dị ứng là chất có khả năng gây ra phản ứng dị ứng, nhưng dung nạp được và vô hại với các cá thể không bị dị ứng [5]

Phản ứng dị ứng xảy ra do hệ miễn dịch của cơ thể quá mẫn cảm Hệ thống miễn dịch nhận nhầm một chất vốn không có hại thành có hại, sau đó tấn công chất này với cường độ vượt mức [5]

Cơ chế gây dị ứng:

Sau khi tiếp xúc với các chất gây dị ứng (do ăn phải, hít phải, tiếp xúc ngoài da), các chất này sau khi đi vào cơ thể sẽ gặp tế bào lympho T, tế bào lympho T khi gặp chất gây dị ứng ngay lập tức sẽ giải phóng cytokine, cytokine tiếp xúc với tế bào B trong cơ thể, hình thành tế bào Plasma Tế bào này sản sinh ra kháng thể IgE, gắn lên bề mặt của các tế bào mast (dưỡng bào) – tế bào tạo máu với khả năng giải phóng các chất trung gian có thể gây viêm và hoạt động như một chất điều hòa miễn dịch Tế bào mast được hoạt hóa khi trên bề mặt các thụ thể gắn Fc của IgE, sản sinh histamine Histamin khi đi vào máu, làm giản mạch

máu, tăng tính thấm của mạch máu, gây kích thích thần kinh, dẫn đến sự ửng đỏ, sưng tấy và ngứa, là những triệu chứng cơ bản của dị ứng [5]

Hình 1.3 Cơ chế gây dị ứng [5]

1.3.2 Bệnh dị ứng thực phẩm

Dị ứng với thực phẩm hiện đang là một trong những vấn đề dinh dưỡng cấp thiết, bởi tất cả các thực phẩm có chứa protein đều có thể là tác nhân gây dị ứng Dị ứng thực phẩm thường gặp nhất là type I do immunoglobulin E xúc tác phản ứng mẫn cảm Biểu hiện lâm sàng của dị ứng thực phẩm khá đa dạng, từ nổi mày đay, ngứa ran, đau bụng, khó thở cho tới sốc phản vệ và có thể dẫn tới tử vong nếu không được cấp cứu kịp thời [6] Dị ứng thực phẩm hiện nay không có thuốc đặc trị Do vậy, đối với người bị dị ứng, hạn chế sử dụng thực phẩm có chứa chất gây dị ứng hoặc sử dụng các thực phẩm không gây dị ứng là giải pháp hữu hiệu duy nhất [7] Vì vậy, các thành phần dị ứng phải được ghi rõ trong danh sách các thành phần, như được quy định trong phần Phụ lục II của EU Food Information, Consumers Regulation, điều số 1169/2011 và điều luật sửa đổi Commission Delegated Regulation (EU) điều số 78/2014 Phụ lục này trình bày 14 chất gây dị ứng (và các sản phẩm của chúng) phải được dán nhãn hoặc chỉ ra là có mặt trong thực phẩm là:

- Ngũ cốc có chứa gluten, cụ thể là lúa mì, lúa mạch, lúa mạch đen và yến mạch

- Động vật giáp xác, ví dụ như tôm, cua, tôm hùm, tôm càng xanh - Trứng

- Cá

- Đậu nành - Đậu phộng

- Sữa (bao gồm lactose)

- Hạt, cụ thể là: hạnh nhân, quả phỉ, quả óc chó, hạt điều, hạt hồ đào, hạt Brazil, hạt hồ trăng, hạt macadamia (hoặc Queensland)

- Cần tây (bao gồm celeriac) - Mustard

- Vừng

- Sulphur dioxide/ sulphites, sản phẩm được thêm vào và ở mức trên 10mg/kg hoặc 10mg/L trong thành phẩm Chất này được sử dụng như một chất bảo quản trong trái cây sấy khô

- Lupin, bao gồm hạt lupin và bột, có thể được tìm thấy trong các loại bánh mì, bánh ngọt và mì ống

- Động vật thân mềm như trai, hàu, ốc biển, ốc sên và mực

1.4 BỆNH DỊ ỨNG ĐẬU PHỘNG

1.4.1 Các triệu chứng của bệnh dị ứng đậu phộng

Phản ứng dị ứng với đậu phộng thường xảy ra trong vòng vài phút sau khi tiếp xúc, và các triệu chứng từ nhẹ đến nặng Triệu chứng dị ứng có thể bao gồm: nổi mề đay ở da, màu da có màu đỏ, đặc biệt là vùng da mặt, có thể sưng tấy; đường hô hấp có hiện tượng khó thở, thở khò khè, ho, nghẹt mũi; người bệnh thường bị nôn mửa, tiêu chảy và đau bụng; nặng nề hơn, người bệnh có khả năng bị tụt huyết áp, nhịp tim không đều, thậm chí là tim ngừng đập [8]

Đậu phộng là một vấn đề nghiêm trọng đối với các bệnh nhân dị ứng vì hai lý do Đầu tiên, một phần ba của tất cả các phản ứng dị ứng nghiêm trọng là do bệnh nhân dị ứng đậu phộng [9] và thứ hai, lượng đậu phộng rất thấp có thể kích hoạt các phản ứng dị ứng [10] Trong những nghiên cứu này, khoảng 100 µg protein đậu phộng là đủ để xuất hiện các phản ứng nhẹ ở người dị ứng đậu phộng Một vấn đề khác cho người bị dị ứng đậu phộng là sự ổn định nhiệt của các chất gây dị ứng trong đậu phộng Trong nghiên cứu của Maleki và cộng sự, tác giả đã mô tả rằng phản ứng IgE với các chất gây dị ứng trong đậu phộng

thậm chí còn tăng lên sau khi rang [11] Do đó, không thể làm giảm tiềm năng gây dị ứng của đậu phộng bằng cách xử lý nhiệt như các thực phẩm khác [12] Cho đến nay, cách duy nhất để người tiêu dùng bị dị ứng đậu phộng tránh các phản ứng dị ứng là tránh sử dụng các loại thực phẩm chứa đậu phộng một cách nghiêm ngặt [7] Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy rằng việc vô tình ăn phải thực phẩm chứa đậu phộng hoặc các chất gây dị ứng trong thực phẩm vẫn rất phổ biến [7]

1.4.2 Tình hình dị ứng đậu phộng

Tỷ lệ dị ứng đậu phộng ở các nước phương Tây đã được tính là cứ 1000 người thì có 1 người bị dị ứng với đậu phộng, thậm chí có những nước cứ 200 người thì có 1 người bị dị ứng đậu phộng [13] Người ta nhận thấy rằng tỷ lệ bị dị ứng đậu phộng đang gia tăng trong những năm vừa qua Nghiên cứu của Sampson và cộng sự (2003) đã chỉ ra rằng tỷ lệ mắc bệnh dị ứng với đậu phộng ở trẻ dưới 5 tuổi ở Mỹ được đã tăng gấp đôi trong 5 năm từ 1998 đến 2003 Một nghiên cứu khác báo cáo rằng dị ứng đậu phộng chiếm 28% số ca bị dị ứng thực phẩm ở trẻ em [14] Thú vị là những người nhập cư vào Mỹ sau khi theo chế độ ăn uống và lối sống của người Mỹ thì nhanh có cùng mức độ dị ứng như dân bản địa Beyer và cộng sự đã chứng minh điều này bằng nghiên cứu thực hiện năm 2001, nghiên cứu chỉ ra rằng mặc dù Trung Quốc là nơi tiêu thụ đậu phộng rất lớn, nhưng số người bị dị ứng với đậu phộng lại thấp hơn rất nhiều so với Mỹ Thế nhưng dân số người Mỹ gốc Hoa sống tại Mỹ đã có tỷ lệ dị ứng đậu phộng tương tự với dân số Mỹ [15] Nguyên nhân của hiện tượng này vẫn đang là một câu hỏi cho các nhà nghiên cứu Trong một báo cáo khác thực hiện tại Mỹ vào năm 2001, 32 trường hợp sốc phản vệ của cơ thể với các loại thực phẩm, đậu phộng là nguyên nhân gây ra 14/32 số ca tử vong [9] Tỷ lệ dị ứng thực phẩm ở châu Á nói chung và ở Việt Nam nói riêng so với quần thể châu Âu tương đối thấp Mặc dù vậy, các số liệu thống từ nghiên cứu của Lee và cộng sự (2013) đã cho thấy sự gia tăng đáng kể của các phản ứng dị ứng ở khu vực này, đặc biệt là dị ứng đậu phộng và các loại hạt

1.4.3 Các phương pháp nghiên cứu phát hiện đậu phộng

Một số nghiên cứu cho thấy rằng việc vô tình ăn phải thực phẩm chứa đậu phộng hoặc các chất gây dị ứng trong thực phẩm rất phổ biến Trong một nghiên cứu của Thụy Điển, xem xét trong 163 trường hợp phản ứng phản vệ nghiêm trọng đối với thực phẩm thì có 62 trường hợp do dán nhãn không đầy đủ trong sản phẩm thương mại và 71 trường hợp là sản phẩm thực phẩm bị nhiễm các thực phẩm gây dị ứng (Malmheden Yman, 2003) Sự nhiễm các chất gây dị ứng ẩn có thể xảy ra do quá trình làm sạch thiết bị sản xuất không đạt, do sử dụng nguyên liệu nhiễm bẩn hoặc do nhãn không được ghi đầy đủ và chính xác [16] Đặc biệt, theo số liệu thống kê từ Tổng cục hải quan cho biết, kim ngạch xuất khẩu bánh kẹo và các sản phẩm từ ngũ cốc của Việt Nam từ đầu năm đến hết tháng 7/2018 đạt 359,4 triệu USD Bánh kẹo và các sản phẩm từ ngũ cốc của Việt Nam được xuất khẩu chủ yếu sang các thị trường Trung Quốc, Mỹ, Hàn Quốc, Đức, Úc, Do đó, việc phát triển các phương pháp phân tích để phát hiện các chất gây dị ứng là cần thiết để giám sát việc thực hiện dán nhãn trên các sản phẩm theo đúng yêu cầu được quy định, nhằm bảo vệ người tiêu dùng khỏi các chất gây dị ứng ẩn và hỗ trợ các nhà sản xuất thiết lập các khái niệm về hệ thống Phân tích mối nguy và điểm kiểm soát tới hạn (HACCPs), kiểm soát các nguy cơ nhiễm

Theo các nghiên cứu trước đây, các xét nghiệm có thể phát hiện cụ thể nồng độ các chất gây dị ứng tương ứng ít nhất ở mức 10 ppm [16][10] Để phát hiện các chất gây dị ứng trong thực phẩm, xét nghiệm miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) có lẽ là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất [17] Phần lớn các hệ thống ELISA đều dựa trên việc phát hiện protein gây dị ứng của thực phẩm [18] Thế nhưng, ngành công nghiệp thực phẩm sử dụng rất nhiều phương pháp chế biến thực phẩm như xử lý với nhiệt hoặc rang, có thể ảnh hưởng đến tính toàn vẹn và chất lượng của protein (Hird et al., 2003) Một phương pháp được kiến nghị có thể thay thế cho việc phát hiện trực tiếp các protein, đó là các phương pháp dựa trên DNA vì so với protein thì DNA ổn định hơn sau các quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm Các phân tử đích của phương pháp phát hiện này không phải protein mà là các chuỗi DNA cụ thể được khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) Đối với việc phát hiện sự có mặt đậu phộng,

các nghiên cứu gần đây đã phát triển phương pháp realtime-PCR, là một phương pháp có thể áp dụng cho mục đích định lượng Ưu điểm chính của việc sử dụng Realtime PCR cho mục đích này là độ đặc hiệu cao Stephan và cộng sự (2004) đã thử nghiệm trên 33 mẫu thực phẩm thương mại bằng cả hai phương pháp ELISA sandwich và Realtime PCR, đã cho kết quả là giá trị Ct thu được bằng phương pháp Realtime PCR ở tất cả các mẫu dương tính phản ánh tương đương lượng protein được đo bằng phương pháp ELISA sandwich [19] Điều này nhấn mạnh rằng realtime-PCR có thể được sử dụng là phương pháp bán định lượng để phát hiện sự hiện diện của đậu phộng Bên cạnh đó, các phương pháp về sinh học phân tử có tính đặc hiệu tốt hơn các phương pháp miễn dịch [17] Do đó, khảo sát và xây dựng quy trình phát hiện các chất gây dị ứng ở đậu phộng bằng kỹ thuật Realtime PCR là cần thiết

Trong nghiên cứu của Stephan và cộng sự (2004), giới hạn nồng độ thấp nhất để phát hiện được đậu phộng là 10 ppm đậu phộng [16], tương đương với 0.001% Ngưỡng gây dị ứng được chứng minh trong nghiên cứu của Taylor và cộng sự (2002) là 1 mg đậu phộng, đây là ngưỡng gây dị ứng thấp nhất được khảo sát trong những nghiên cứu trước đây Giả sử mẫu thực phẩm có nồng độ 10 ppm đậu phộng, thì người bệnh có khả năng tiêu thụ một lượng thực phẩm lớn hơn 100 g (chứa nhiều hơn 1 mg đậu phộng) và gây ra phản ứng dị ứng Do đó, để đảm bảo tính hiệu quả của quy trình, thí nghiệm cần khảo sát được nồng độ đậu phộng tối thiểu là 0.001% Từ đó, xác định được nồng độ đậu phộng thấp nhất mà quy trình có thể phát hiện được

1.5 PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR 1.5.1 Định nghĩa

Real-time PCR hay còn gọi là PCR thời gian thực là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng Kết quả cuối cùng của phản ứng khuếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi phản hoàn thành phản ứng khuếch đại Nhờ đó, với real-time PCR, người làm thí nghiệm không cần phải thiết lập các bước thí nghiệm khác để đọc và phân tích kết quả Real-time PCR được thực hiện trong máy có buồng ủ nhiệt, chạy được chương trình luân nhiệt như máy PCR bình thường, nhưng có thêm một thiết bị

có khả năng phát ra các tia sáng kích thích (excitation light) lên các mẫu với chiều dài bước sóng nhất định và có camera hoặc cảm biến quang xác định được ánh sáng huỳnh quang phát ra ( từ các phân tử huỳnh quang đã được kích hoạt Từ đó máy có thể xác định được tín hiệu huỳnh quang thay đổi sau mỗi chu kỳ do số lượng phân tử DNA được tổng hợp tăng lên

Có hai phương pháp phổ biến được sử dụng trong real-time PCR để định lượng sản phẩm đó là sử dụng chất huỳnh quang và các đầu dò huỳnh quang (probe) Chất huỳnh quang là một loại màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA, có ái lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi đôi DNA, nhờ đó làm cho sợi đôi DNA phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích Khi không có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại, chất huỳnh quang bị phân tán trong dung dịch PCR mix, do vậy, các tube chứa mẫu sẽ không phát huỳnh quang hoặc chỉ phát một cách không đáng kể khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích Nhưng khi có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại của PCR, màu huỳnh quang sẽ làm cho tube phản ứng phát huỳnh quang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích Probe là những đoạn oligonucletidea sợi đơn có trình tự có thể bắt cặp bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản ứng, thì probe sẽ bắt cặp lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại và phát huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích [20]

1.5.2 Biểu đồ khuếch đại của real-time PCR

Người làm thí nghiệm có thể quan sát được kết quả khuếch đại trong quá trình nhân bản DNA trong real-time PCR nhờ vào biểu đồ khuếch đại (amplification graph) Biểu đồ có trục tung (Y) là cường độ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận ánh sách kích thích, còn trục hoành (X) là các chu kỳ nhiệt Ở biểu đồ khuếch đại của real-time PCR, giai đoạn đầu tiên, khi mà cường độ huỳnh quang mà máy ghi nhận được trong những chu kỳ đầu rất thấp và hầu như không thấy, biểu đồ sẽ hiển thị bằng một đường thằng nằm ngang, được gọi là “giai đoạn ủ” hay “giai đoạn tiềm phục” Khi số lượng bản sao của DNA đích đạt đến một ngưỡng nhất định thì ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ đủ cường độ để được máy ghi nhận, lúc này đường biểu diễn khuếch đại

sẽ bắt đầu đi lên Cường độ huỳnh quang trong ống phản ứng từ lúc này sẽ tăng nhanh sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lượng bản sao DNA địch tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ Giai đoạn này được gọi là “giai đoạn lũy thừa Khi phản ứng đã cạn dần dNTP và enzyme taq polymerase, cường độ huỳnh quang sẽ chậm dần và đạt đến bình nguyên, giai đoạn này được gọi là “giai đoạn bình nguyên”

Các giá trị thể hiện trong biểu đồ của Realtime-PCR gồm có: (1) Baseline (đường nền) là giá trị tín hiệu huỳnh quang tại các chu kỳ đầu của phản ứng; (2) Threshold (ngưỡng) là điểm bắt đầu của sự phát hiện tín hiệu huỳnh quang, tại thời điểm này có thể phân biệt sản phẩm PCR với đường nền; (3) Cycle thresold (Ct – chu kỳ ngưỡng hay Cq – chu kì định lượng) là số chu kỳ mà tại đó sản phẩm khuếch đại có thể được phát hiện bởi sự thay đổi của tín hiệu huỳnh quang; (4) Amplification curve (đường biểu diễn) cho biết tín hiệu huỳnh quang phát ra tại từng chu kỳ phản ứng PCR Ngoài ra còn có các khái niệm khác như Melting curve (phân tích độ đặc hiệu dựa trên nhiệt độ nóng chảy), Standard curve (đường chuẩn),…[20]

Hình 1.4 Biểu đồ đường biểu diễn khuếch đại của phản ứng real-time PCR[20]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Các phần mềm và trang web được sử dụng

NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/): Ngân hàng cơ sở dữ liệu dùng cho việc khai thác thông tin

BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi): Công cụ trực tuyến trên NCBI giúp so sánh, tìm kiếm các trình tự tương đồng trên ngân hàng cơ sở dữ liệu với trình tự mục tiêu

IDT analyzer (https://sg.idtdna.com/calc/analyzer): phần mềm trực tuyến giúp xác định các thông số vật lí của mồi: chiều dài mồi, %GC, nhiệt độ nóng chảy, khả năng hình thành các cấu trúc thứ cấp (Hairpin-dimer, Self-dimer, Hetero-dimer)

Annhyb (phiên bản 4.946): khảo sát sự bắt cặp đặc hiệu của mồi với các trình tự gene mục tiêu

Clustal X (phiên bản 2.1): phần mềm hỗ trợ sắp gióng cột các trình tự, phân tích tương đồng

2.1.3.2 Thiết bị

Máy vortex (Vortex ZX3, Velp Ý), Máy ly tâm (MRC ECEN-205, MRC), Máy ủ nhiệt khô (SHB130 STUART, Anh), Tủ hút khí độc (FurniLAB, Việt Nam), Máy Realtime PCR (LightCycler® 96, Roche), Bộ điện di

2.1.3.3 Hóa chất cho quá trình tách chiết:

Mẫu được khảo sát quy trình tách chiết bằng ba bộ kit tách chiết DNA của công ty ABT

- Các hóa chất trong bộ HI-121-DNA Plant Extraction Kit của công ty ABT: CL Buffer, WB1 Buffer, WB2 buffer, EB buffer, Proteinase K, Ethanol

- Các hóa chất trong bộ HI-111-DNA Genome Extraction Kit của công ty ABT: PLS1 Buffer, PLS2 Buffer, PBB Buffer, PWB Buffer, EB Buffer, Ethanol, Rnase A

- Các hóa chất trong phương pháp Phenol/Chloroform: Dung dịch đồng nhất, SDS, Proteinase K, NaCl, dung dịch Phenol, Chloroform buffer, Isoamyl buffer, NaOAC buffer, Isopropanol buffer, EtOH buffer, TE 1X buffer

2.1.3.4 Hóa chất cho quá trình real-time PCR và điện di

SensiMix Probe No Rox (Bioline), Primer forward 100nM, Primer reverse 100 nM, Taqman probe FAM, dd H2O (đã hấp), Agarose (cat# AB0013), TBE 1X (DD-027), Gelred DNA loading buffer tricolor 6X, thang chuẩn 100bp và một số hóa chất khác

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Khai thác dữ liệu

Tiến hành tìm kiếm các thông tin về đậu phộng, bệnh dị ứng, các protein gây dị ứng ở đậu phộng, các nghiên cứu phát hiện đậu phộng trên cơ sở dữ liệu NCBI bằng một số từ khóa: peanut, Allergy, Arachis Hypogaea, Detection peanut, Ara H2, và thu thập các bài báo liên quan dựa trên các tạp chí uy tín như Journal of Clinical Oncology, Journal of Allergy and Clinical Immunology, Journal of Immunological Methods, linical and Experimental Allergy, European Food Research and Technology, Current Biology, Journal of Agricultural and Food Chemistry

2.2.2 Khảo sát in silico

Dựa vào những công trình nghiên cứu tìm được trên các tạp chí uy tín thế giới liên quan đến các việc phát hiện đậu phộng trên các loại mẫu, tiến hành thu thập các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu, loại mẫu, cỡ mẫu Thu thập thông tin và trình tự các cặp mồi khuếch đại các gen mục tiêu từ các bài báo trên NCBI Việc đánh giá mồi bằng phần mềm trực tuyến IDT dựa theo những tiêu chí sau: chiều dài nằm trong khoảng 17-28 bp, %GC nằm trong khoảng 40-60% (nếu hàm lượng %GC cao hơn có thể không biến tính tốt trong quá trình realtime PCR), nhiệt độ nóng chảy Tm nằm trong khoảng 50-65oC, các cấu trúc thứ cấp như Hairpin loop (cấu trúc kẹp tóc), Self dimer (cấu trúc tự bắt cặp), Hetero dimer (cấu trúc dị bắt cặp) Cách xác định độ bền vững giữa các cấu trúc này dựa trên mức năng lượng tự do delta G (Delta G phải lớn hơn hoặc nằng -9 kcal/mole) Xác định tính đặc hiệu, độ tương đồng của mồi bằng công cụ BLAST, phần mềm Annhyb