xác định solasodine từ dịch chiết rễ bất định cà gai leo solanum hainanense hance in vitro trong môi trường có bổ sung dịch chiết hoa mười giờ potulaca grandiflora hook

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

XÁC ĐỊNH SOLASODINE TỪ DỊCH CHIẾT RỄ BẤT ĐỊNH CÀ GAI LEO (SOLANUM

HAINANENSE HANCE) IN VITRO TRONG MÔI

TRƯỜNG CÓ BỔ SUNG DỊCH CHIẾT HOA

MƯỜI GIỜ (POTULACA GRANDIFLORA HOOK)

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: NÔNG NGHIỆP-DƯỢC-MÔI TRƯỜNG

CBHD: ThS Nguyễn Trần Đông Phương

SVTH: Nguyễn Thị Hồng Diễm MSSV: 1253012050

Khóa: 2012 – 2016

Bình Dương, tháng 05 năm 2016

LỜI CẢM ƠN

Đề tài này được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, khoa Công nghệ sinh học Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, cơ sở 3, Bình Dương, dưới sự hướng dẫn và giúp đỡ của các thầy cô Để hoàn thành đề tài này, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

- Giảng viên hướng dẫn ThS Nguyễn Trần Đông Phương đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cũng như động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

- Các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học đã giảng dạy em trong suốt 4 năm học qua

- Ban quản lý phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện cho em sử dụng phòng thí nghiệm và mượn thiết bị thí nghiệm để thực hiện đề tài

- Các anh chị, các bạn và các em trong phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào đã giúp đỡ và ủng hộ tôi rất nhiều trong quá trình nghiên cứu và học tập

- Những người bạn cùng phòng trọ tuyệt vời nhất mà tôi từng có, đã chăm lo, chia sẻ mọi điều trong cuộc sống, tôi xem các bạn như gia đình của tôi vậy

- Đặc biệt, con xin nói lời cảm ơn vô hạn đến ba mẹ, người đã có công sinh thành, nuôi dường và dạy dỗ con nên người Cảm ơn ba mẹ luôn là người quan tâm, chăm sóc và lo lắng cho con nhiều nhất, kể cả khi đi học xa nhà con vẫn luôn cảm nhận được tình cảm tuyệt vời mà ba mẹ đã dành cho con Cảm ơn em trai và em gái đã thay chị quan tâm, ở bên ba mẹ khi chị vắng nhà và còn động viên, an ủi chị Con thương và nhớ gia đình nhiều lắm

Bình Dương, tháng 05 năm 2016

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

I.1 Sơ lược về họ Cà Solanaceae 3

I.2 Sơ lược về cây Cà gai leo Solanum hainanense Hance 3

I.2.1 Vị trí phân loại 3

I.2.2 Nguồn gốc, phân bố 4

I.2.3 Đặc điểm hình thái 4

I.2.4 Thu hái và chế biến 5

I.2.5 Thành phần hợp chất có trong cây 5

I.3 Nuôi cấy mô, tế bào thực vật 9

I.3.1 Khái niệm 9

I.3.2 Cơ sở và ứng dụng 9

I.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng 10

I.3.4 Sự phát sinh rễ bất định trong nuôi cấy mô 15

I.3.5 Sự kháng oxy hóa 16

II.2.2 Điều kiện nuôi cấy in vitro cây Cà gai leo 20

II.3.5 Xác định solasodine trong rễ bất định Cà gai leo 23

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

III.1 Kết quả khảo sát sự hình thành rễ bất định từ đoạn thân Cà gai leo in vitro trong môi trường có bổ sung dịch chiết Hoa mười giờ 26

III.2 Hình thái giải phẫu mẫu rễ Cà gai leo 31

DANH MỤC VIẾT TẮT

Hình 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết Hoa mười giờ đến sự phát sinh rễ bất

định từ đoạn thân sau 2 tuần nuôi cấy……… 28

Hình 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết Hoa mười giờ đến sự phát sinh rễ bất định từ đoạn thân sau 4 tuần nuôi cấy 29

Hình 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết Hoa mười giờ đến sự phát sinh rễ bất định từ đoạn thân sau 8 tuần nuôi cấy 30

Hình 3.4: Mặt cắt ngang của mẫu rễ Cà gai leo sau 8 tuần nuôi cấy 31

Hình 3.5: Mặt cắt ngang rễ phụ của Cà gai leo sau 8 tuần nuôi cấy 31

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Khảo sát nồng độ dịch chiết hoa mười giờ ảnh hưởng đến khả năng tạo rễ từ đoạn thân Cà gai leo 22 Bảng 3.1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết Hoa mười giờ đến sự phát sinh rễ bất định từ đoạn thân 26 Bảng 3.2: Khả năng kháng oxi hóa của cao chiết rễ cây Cà gai leo in vitro 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) hay Solanum procumben Lour là một cây

thuốc có giá trị được tìm thấy trong nhiều khu vực của Trung Quốc và Việt Nam,

hoạt chất kháng viêm và bảo vệ gan quan trọng do chúng có tác dụng ức chế sinh tổng hợp collagen và hạn chế sự tạo thành xơ ở một số tổ chức mô liên kết Ngoài ra, glycoalkaloid còn có tác dụng hạn chế sự phát triển khối u, làm bất hoạt các virus gây bệnh mụn giộp ở người như Herpes simplex, Herpes zoster và Herpes

chủ yếu glycoalkaloid, vì vậy vấn đề đặt ra là nếu thu hái trong tự nhiên, để thu được rễ phải nhổ cây, như vậy sẽ rất hao phí và tốn thời gian tái tạo lại nguồn

Với việc ứng dụng các hiệu quả của nuôi cấy mô, nguồn nguyên liệu là rễ Cà gai leo cung cấp cho dược liệu đã đồng nhất hơn, đặc biệt số lượng cũng có thể tăng theo nhu cầu sử dụng nếu áp dụng nuôi cấy tạo rễ bất định in vitro Trong đề tài khóa luận tốt nghiệp của Đồng Văn Trọng: “Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định của Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) in vitro và khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết từ rễ cây” bổ sung chất điều hòa sinh trưởng IAA thuộc nhóm auxin đã cho kết quả là từ mẫu nuôi cấy đạt trung bình là 34,44 rễ, chiều dài

kích thích sự phát triển của thực vật, tác dụng đến các quá trình sinh trưởng của tế bào như hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sự sinh trưởng của quả và tạo ra quả không hạt, hoạt động của tầng phát sinh và sự hình thành rễ bất định, là rễ đươc tạo từ các bộ phận bất kỳ trên cây mà không phải gốc cây Tuy nhiên, IAA được sử dụng trong đề tài này là hợp chất tổng hợp hóa học nên sẽ có ảnh hưởng đến các chất có hoạt tính sinh học mà cây tổng hợp trong quá trình sinh

trưởng Cho nên, chúng tôi sử dụng dịch chiết Hoa mười giờ (Portulaca

grandiflora Hook) thuộc họ Rau sam – Portulacaceae chứa hàm lượng auxin[35]

có lợi cho mục đích tạo rễ cho thí nghiệm, góp phần tạo nguồn nguyên liệu an toàn,

Chúng tôi thực hiện đề tài: “Xác định solasodine từ dịch chiết rễ bất định Cà

gai leo (Solanum hainanense Hance) in vitro trong môi trường có bổ sung dịch chiết Hoa mười giờ (Portulaca grandiflora Hook)” nhằm tạo số lượng lớn rễ bất

định Cà gai leo in vitro an toàn để ly trích chất solasodine

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I.1 Sơ lược về họ Cà Solanaceae

Họ Cà Solanaceae bao gồm khoảng 90 chi và trên 2.600 loài phân bố tập trung ở các vùng nhiệt đới Ở Việt Nam có khoảng 70 loài gồm các cây thân thảo hoặc cây nhỏ Một số loài cây được trồng với mục đích công nghiệp (thuốc lá

-Nicotiana tabacum), làm thuốc (cây cà dược -Atropa belladonna, cà gai leo -Solanum hainanense), làm cảnh (cây dã yên thảo -Petunia hybrida) và đặc biệt là

cây trồng, trong đó có ý nghĩa toàn cầu như khoai tây, cà chua, ớt, cà tím và ý nghĩa địa phương như dưa chuột trái cây (Pepino ait), Solanum betaceum,

Cyphomandra

nhau về hình dạng và kích thước, thường không có lá kèm hay thay thế Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5 Quả mọng nước hoặc quả nang Một số loài có hợp chất alkaloid (atropine, nicotine, solanine, tomatine) mà trong một số trường hợp được

I.2 Sơ lược về cây Cà gai leo Solanum hainanense Hance

I.2.1 Vị trí phân loại

Tên đồng nghĩa: Solanum procumbens Lour

Tên gọi khác: Cà vạnh, cà cườm, cà quánh, cà quýnh, cà gai dây, cà lù, cà bò[1]

Hình 1.1: Cà gai leo

I.2.2 Nguồn gốc, phân bố

Cà gai leo là loại cây nhỏ sống nhiều năm, phân bố ở các tỉnh miền núi phía Bắc (Bắc Giang, Phú Thọ), các tỉnh Trung Bộ (Thanh Hóa, Nghệ An, Khánh Hòa, Gia Lai) và một số vùng ở Nam Bộ Các tỉnh Hòa Bình, Nam Định, Quảng Trị, Nghệ An, Thanh Hóa có nhiều Cà gai leo hơn cả

Cà gai leo là cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng, thường mọc tập trung nhiều cá thể, lẩn trong các lùm bụi thưa ở quanh làng, bãi hoang, kể cả các bụi tre gai Cây mọc ở chỗ nhiều ánh sáng, sinh trưởng và phát triển tốt, ra nhiều hoa quả, Cà gai leo có khả năng tái sinh bằng hạt hoặc từ các phần thân và các gốc còn lại sau khi chặt Ngoài ra, từ các đoạn than và cành trồng vào mùa xuân cũng có thể mọc thành cây mới, thường mọc ở vùng núi thấp đến trung du và đồng bằng ven biển Nguyên nhân chủ yếu do vấn đề thổ nhưỡng và khí hậu của vùng này phù

I.2.3 Đặc điểm hình thái

Cà gai leo thuộc họ leo nhỡ, dài hơn 1 m, phân nhiều cành; cành non tỏa rộng, phủ lông hình sao và có rất nhiều gai màu vàng, dài 2-5 mm Lá hình trứng, hình bầu dục, chóp tù hoặc nhọn, gốc nêm hoặc tròn, mép lá thường có 5 thùy lượn sóng, ít khi nguyên, mặt trên màu xanh đậm có lông hình sao thưa, mặt dưới màu xanh nhạt có lông hình sao dày; cuống lá dài 0,4-0,5 cm, có gai nhỏ

Cụm hoa Cà gai leo dạng tán ở đỉnh cành, hiếm khi mọc ở nách lá; cuống chung dài 3-5 mm Hoa có cánh màu trắng, nhụy màu vàng, mẫu 4; cuống hoa dài 12-15 mm Đài hình chén, dài 3-4 mm; thùy đài hình tam giác, không đều, dài 1-2 mm, ở mặt dưới có lông măng hình sao Tràng màu trắng hoặc tím nhạt, dài 1 cm; thùy tràng hình mũi mác, dài 6-7 mm, ở mặt ngoài có lông hình sao Nhị 4; chỉ nhi dài 1 mm; bao phấn dài 6 mm Bầu nhẵn; vòi nhụy dài 7 mm, có lông ở gốc Quả mọng màu vàng, khi chín màu đỏ sáng, hình cầu, đường kính 5-7 mm Hạt màu vàng

I.2.4 Thu hái và chế biến

Cây cà gai leo ra hoa vào mùa hè, có quả vào mùa thu Thường người ta đào rễ quanh năm, rửa sạch thái mỏng phơi hay sấy khô làm thuốc, có thể dùng tươi, không phải bào chế gì khác

I.2.5 Thành phần hợp chất có trong cây I.2.5.1 Alkaloid

Alkaloid nói chung là những chất có hoạt tính sinh học, có nhiều chất rất độc Alkaloid có trong Cà gai leo là solasodine, solanine và solanidine có ở toàn cây và nhiều ở rễ

Solasodine là glycoalkaloid steroid có chứa nitơ, thu được từ các bộ phận khác nhau của chi Solanum thuộc họ Cà Solanaceae và có tác dụng điều trị khác nhau Solasodine đã được sử dụng trong các ngành công nghiệp thuốc để tổng hợp

Solasodine có hoạt tính sinh học như kháng nấm, ức chế sự tăng trưởng của côn trùng và có

của chuột và chứng tỏ khả năng chống xơ gan trên chuột Solasodine có tác dụng

Solanine là một loại glycoalkaloid, có vị đắng và khá độc, có nguồn gốc từ mầm khoai tây, cà chua và các cây khác trong họ Cà Solanaceae Solanine có tính gây mê và trước đây được dùng để chữa chứng động kinh Solanine được tạo thành từ

xơ do vừa có tác dụng ức chế sinh tổng hợp colagen lại vừa có vai trò kích hoạt colagenase làm hoạt hóa enzym này phân giải colagen làm giảm xơ

Cà gai leo còn có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, làm giảm tổn thương do oxy hóa gây ra ở gan Kích thích sự tăng trưởng của các tế bào lympho T tác dụng lên hệ miễn dịch, ức chế một số dòng tế bào ung thư gan, ung thư cổ tử cung Theo kinh nghiệm của dân gian Cà gai leo dùng chữa ngộ độc rượu rất tốt Cà gai leo có vị hơi the, tính ấm, hơi có độc Rễ và quả dùng trị mụn nhọt, lở ngứa Nước sắc của rễ uống chống say rượu Trong rễ có chứa solasodine dùng trị cảm cúm, ho

I.2.7 Các nghiên cứu về Cà gai leo

Năm 1991, Nguyễn Thị Minh Khai phát hiện ra dịch chiết của cây Cà gai leo có tác dụng ngăn chặn sự phát triển xơ trên mô hình gây xơ gan thực nghiệm trên chuột

Năm 1998, Nguyễn Phúc Thái thực hiện đề tài: “Nghiên cứu lâm sàng, cận lâm sàng tổn thương gan do tiếp xúc nghề nghiệp với trinitrotoluen (TNT) và thăm dò tác dụng bảo vệ gan của Cà gai leo trên thực nghiệm” cho kết quả dịch chiết từ cây Cà gai leo có tác dụng đáng kể trong việc bảo vệ gan dưới tác dụng độc của TNT trong nghiên cứu thực nghiệm kéo dài 6 tuần Những tác dụng thể hiện rõ thông qua việc hạn chế hủy hoại tế bào gan (giảm bớt việc tăng men gan so với lô chuột không uống Cà gai leo); hạn chế việc tăng trọng lượng gan do nhiễm độc TNT và giảm bớt các biểu hiện tổn thương gan trên tiêu bản vi thể (lô uống TNT có Cà gai leo không bị mất cấu trúc nan hoa tiểu thùy gan và không có hiện tượng chảy máu nhu mô gan) Đây là những bằng chứng cụ thể về hiệu quả bảo vệ gan của dịch

Năm 2000, Nguyễn Thị Minh Khai và cộng sự thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thuốc từ Cà gai leo làm thuốc chống viêm và ức chế sự phát triển của xơ gan” - đã chứng minh tác dụng bảo vệ gan, ức chế sự phát triển xơ gan của dạng chiết toàn phần

Năm 2001, Nguyễn Thị Minh Khai và cộng sự đã nghiên cứu điều trị hỗ trợ bệnh

nhân viêm gan virus B mãn tính thể hoạt động (giai đoạn 3) bằng thuốc từ Cà gai leo, thử lâm sàng trên 50 bệnh nhân viêm gan B mãn tính thể hoạt động rút ra kết luận rằng 66,7% đã giảm các triệu chứng của bệnh viêm gan như vàng da, vàng mắt, đau hạ sườn, nước tiểu vàng, mệt mỏi Ngoài ra, thuốc còn không gây bất kỳ

Năm 2002, Nguyễn Thị Bích Thu thực hiện đề tài: “Nghiên cứu cây Cà gai leo làm thuốc chống viêm gan và ức chế xơ gan” - đã thử tác dụng của dạng chiết toàn phần Cà gai leo trên mô hình chống viêm mạn, trên colagenase, mô hình xơ gan thực nghiệm, tác dụng chống oxy hoá và đã xác định hoạt chất chính có tác dụng ức chế sự phát triển của xơ gan, chống viêm, bảo vệ gan trong cao toàn phần của Cà gai leo là glycoalkaloid và còn phát hiện những tác dụng dược lý mới của Cà

Năm 2011, Nguyễn Hoàng Lộc và Huỳnh Văn Kiệt đã nghiên cứu phương pháp

trường MS chứa 3% Sucroza và 0,8% agar, bổ sung với 0,1 mg/L IBA, 1,8 mg/L kinetin và 3,8 mg/L BAP để tăng sinh, sau đó chồi non được cấy vào MS với 3%

Năm 2011, Nguyễn Hoàng Lộc và Lê Thị Hà Thanh đã thực hiện phân tách solasodine từ mô sẹo cây Cà gai leo cấy trong môi trường MS có chứa 3% (w/v) sucrose, bổ sung 0,1 mg/L benzylaminopurine (BAP) và 1,0 mg/L 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D) để tăng sinh mô sẹo Sau đó nuôi tế bào ở dạng huyền phù 4 tuần trong môi trường tương tự nhưng bổ sung 4% (w/v) sucrose để thu sinh khối, có máy lắc với tốc độ 150 rpm, thể tích là 20 mL Phân tích kết quả bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) cho thấy solasodine trong dịch treo tế bào sau 4 tuần tuổi (121,01 mg/g) là cao hơn so với rễ cũ 1 năm

I.3 Nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Nuôi cấy mô thực vật là một trong những ứng dụng đạt được nhiều thành công nổi bật của công nghệ sinh học thực vật

I.3.1 Khái niệm

Thuật ngữ “nuôi cấy mô, tế bào thực vật” được dùng một cách rộng rãi để nói về việc nuôi cấy tất cả các phần của thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong điều

I.3.2 Cơ sở và ứng dụng

Tính toàn năng của tế bào: mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh

Sự phân chia, phân hóa, phản phân hóa của tế bào: cơ thể thực vật trưởng thành là một thể thống nhất gồm nhiều cơ quan có chức năng khác nhau và bắt nguồn từ một tế bào hợp tử ban đầu Tế bào này phân chia thành một khối tế bào chưa chuyên hóa rồi biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc trưng cho từng mô và cơ quan chức năng khác nhau Đây là hiện tượng phân hóa tế bào Tuy nhiên, các tế bào chuyên hóa đó không mất đi hoàn toàn sự biến đổi của mình Trong những điều kiện thích hợp, các tế bào chuyên hóa có thể trở thành các tế bào chưa chuyên hóa Đây là hiện tượng phản phân hóa tế bào (Trịnh Đình Đạt, 2009)

Ứng dụng của nuôi cấy mô là nhân giống nhanh với số lượng lớn; tạo giống cây trồng sạch bệnh và đồng nhất về mặt di truyền; sản xuất giống cây trồng không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên; tế bào thực vật và các mô nuôi cấy cung cấp một phương tiện tiềm năng cho nghiên cứu sinh tổng hợp và tích lũy của chất chuyển

I.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng I.3.3.1 Mẫu cấy

Mẫu cấy được tách ra từ cơ thể mẹ sạch bệnh và phát triển trong điều kiện dinh dưỡng tốt Tình trạng tuổi sinh lý của mẫu cấy không nên quá già hay quá non, sự hình thành rễ từ mô của những cây còn non dễ hơn là những cây đã trưởng thành; tử diệp có khả năng tái sinh cao hơn lá; cặp lá đầu tiên tái sinh tốt hơn các lá mọc sau

Trong quá trình nuôi cấy thì vị trí lấy mẫu cũng ảnh hưởng rất nhiều, mặc dù mẫu cấy được lấy trên cùng một cơ quan nhưng khả năng tái sinh của mỗi mẫu khác nhau là do một cơ quan được cấu tạo bởi nhiều mô khác nhau và có độ tuổi khác nhau Khả năng tái sinh của mẫu cấy thay đổi theo tùy loài thực vật, cây thân thảo tái sinh dễ hơn nhiều so với cây bụi và cây thân gỗ do tổ chức giải phẫu thực vật khác nhau; ở thực vật phân biệt giới tính (ví dụ như cây Kiwi- Actinidia chinensis) thì cây cái dễ tái sinh hơn cây đực Mẫu cấy có kích thước lớn đôi khi dễ tái sinh hơn những mẫu có kích thước nhỏ, do mẫu lớn có nguồn dự trữ dinh dưỡng dồi dào hơn

Mẫu cấy sau khi lựa chọn được rửa sạch bằng xà phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride, chlorur thủy ngân, sodium

I.3.3.2 Môi trường nuôi cấy

Trong nuôi cấy mô, môi trường nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng nhất quyết định sự tăng trưởng và phát sinh hình thái tế bào Môi trường nuôi cấy thực vật tùy theo loại, bộ phận nuôi cấy, giai đoạn phân hóa của mẫu cấy Tuy vậy, tất cả môi trường nuôi cấy đều bao gồm năm thành phần: khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, đường, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA ) và một số chất có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm lên men

Một số công thức môi trường được sử dụng chủ yếu để nuôi cấy mô, tế bào thực

vật được mô tả bởi White, Murashige và Skoog, Gamborg và cộng sự (1962), Và đặc biệt môi trường sử dụng nuôi cấy phải đảm bảo yếu tố vô trùng, tức là không có các yếu tố vi sinh tồn tại trong môi trường mà mắt thường có thể nhìn thấy[10][18]

Nhiệt độ

và sự tăng trưởng của tế bào nuôi cấy Nhiệt độ kích thích sự ra rễ tốt nhất là

Toivonen và cộng sự (1992) nhận thấy khi giảm nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy sẽ làm tăng lượng acid béo tổng số trong mỗi tế bào (tính theo trọng lượng khô)[11][4]

pH

Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến sự hòa tan các muối khoáng cần thiết cho cây Người ta thường chỉnh pH khoảng 5,7 - 5,8, đây là mức tốt để cây có thể hấp thụ muối khoáng Những thay đổi của pH chủ yếu do nhiệt độ, thời gian khử trùng,

Sự thoáng khí

và hô hấp Mục đích của tăng cường trao đổi không giữa bình nuôi cấy và môi trường bên ngoài nhằm: tăng hàm lượng CO2 ở mức tối ưu trong bình nuôi cấy nhằm tăng cường khả năng quang hợp của cây in vitro; giảm hàm lượng ethylen và độc tố; giảm hàm lượng O2 trong bình nuôi cấy xuống khoảng 10%; giải quyết vấn đề thủy tinh thể của cây do độ ẩm trong bình nuôi cấy cao; hình thành hệ rễ

Muối khoáng

Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với nhu cầu của cây ngoài tự nhiên Vì vậy, việc bổ sung đầy đủ các khoáng đa lượng và vi

Nguồn carbon

Nguồn carbon chủ yếu cho mô nuôi cấy là đường Mô tế bào nuôi cấy có sự quang hợp giới hạn, vì vậy người ta cần thêm glucose cần thiết cho sự tăng trưởng của

Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau, các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamin HCl (vitamin B1),

Agar

Agar là một polyosid có trọng lượng phân tử cao, được chiết ra từ rong biển loại gelidium Có tác dụng làm giá thể giúp mô nuôi cấy không bị ngập trong môi trường gây chết mô do thiếu oxi Tuy nhiên, người ta ít biết về sự ảnh hưởng của agar và nồng độ của nó trên sự ra rễ bất định Theo Németh (1986), sự hình thành rễ bất định, đặc biệt là cây thân gỗ không được tốt trong môi trường có agar; vì vậy đôi khi người ta dùng môi trường lỏng để nuôi cấy các loại cây thân gỗ Hơn nữa, nếu được cấy trong môi trường quá đặc thì rễ khi hình thành sẽ mọc hướng

Than hoạt tính

Than hoạt tính ảnh hưởng trên ba mặt: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hoà sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy hoặc làm đen môi trường tạo điều kiện để phát sinh rễ Khả năng kích thích sự tăng trưởng của tế bào mô thực vật là do than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời

I.3.3.4 Chất điều hòa sinh trưởng

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (còn gọi là các hocmon sinh trưởng) là những chất được sinh ra trong cây để điều khiển các quá trình sinh trưởng phát triển của cây Bao gồm 2 nhóm: một là nhóm kích thích sinh trưởng có auxin, cytokinin, gibberelin và hai là nhóm ức chế sinh trưởng có acid absicic, ethylen và các hợp chất phenol

Hiện nay người ta đã xác định được cấu tạo hóa học của các chất này và đã điều chế được những chất có tác dụng tương tự như các chất điều hòa sinh trưởng sinh ra trong cây để ứng dụng trong sản xuất

Auxin

Auxin rất cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào nên nó có vai trò quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật Auxin được tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non (tức là nơi có sự phân chia tế bào nhanh) Sau đó, auxin di chuyển tới rễ và tích tụ trong rễ (Taiz và Zeiger, 2002; Bùi Trang Việt, 2000)

Auxin có tác động mạnh mẽ lên sự tăng trưởng tế bào, sự acid hóa vách tế bào, cảm ứng sự phân chia tế bào, kích thích sự hình thành mô sẹo, sự phát triển rễ và kích thích sự phân hóa mô dẫn Auxin kích thích sự kéo dài tế bào diệp tiêu và tế bào vùng kéo dài dưới ngọn của thân Sự kéo dài tế bào rễ cần những nồng độ thấp hơn nhiều so với tế bào thân (Bùi Trang Việt, 2000)

Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ nhưng cản sự tăng trưởng của các sơ khởi rễ này (Mai Trần Ngọc Tiếng và Cs, 1980) Auxin được vận chuyển hướng gốc, tích lũy ở phần gốc của khúc cắt trụ hạ diệp của cà chua và cảm ứng sự hình thành rễ bất định (Kuroha và Cs, 2002) Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp

với các vitamin (như thiamin mà rễ không tổng hợp được), acid amin (như arginin), nhất là các hợp chất ortho-diphenolic (như acid cafeic, acid chlorogenic)

Trong số các loại auxin được sử dụng trong nuôi cấy in vitro, 2,4-D được xem là một auxin mạnh, có tác động hình thành mô sẹo Tuy nhiên, nếu sử dụng ở nồng độ quá cao, auxin này sẽ gây độc cho tế bào, thậm chí gây biến đổi di truyền (Li và Cs, 1998) Trong sự hình thành sơ khởi của rễ bất định, sử dụng NAA, IAA hay IBA thường đạt hiệu quả cao hơn so với 2,4-D Tuy nhiên, tác động của auxin ngoại sinh trong sự phát sinh cơ quan còn tùy thuộc vào trạng thái sinh lý cũng như hàm lượng chất điều hòa nội sinh trong nuôi cấy Trong suốt quá trình tạo rễ bất định, hàm lượng IAA nội sinh tích lũy tăng cao Điều này được giải thích là do auxin ngoại sinh ức chế hoạt động của enzyme IAA oxidase và IBA có khả năng chuyển đổi thành IAA do đó cũng làm tăng nhanh lượng IAA nội sinh, kích thích

Cytokinin

Mô phân sinh ngọn rễ là nơi tổng hợp chủ yếu các cytokinin tự do cho cả cơ thể thực vật Ở rễ, cytokinin cản sự kéo dài nhưng kích thích tăng rộng tế bào (sự tăng trưởng củ) Cytokinin ngăn cản sự lão hóa, thúc đẩy sự trưởng thành của diệp lạp và là nhân tố chính điều khiển quá trình tái sinh mạch giúp cho sự tạo chồi (Taiz và Zeiger, 2002) Trong sự hình thành chồi, cytokinin có thể được xử lý riêng rẽ hay phối hợp các loại để làm tăng khả năng hình thành và chất lượng chồi

Ở nồng độ cytokinnin cao sẽ đưa đến kết quả là tạo thành các cụm chồi Số lượng chồi hình thành tùy thuộc vào nồng độ cytokinin Tuy nhiên, cũng có những bất lợi nhất định trong việc điều chỉnh nồng độ để cảm ứng tạo nhiều chồi Cytokinin ở nồng độ thấp kích thích sự phát triển chồi nách, nồng độ cao hơn sẽ cảm ứng hình thành chồi bất định nhưng chồi rất khó ra rễ

Ở một số loài thực vật, mặc dù sự hình thành chồi được cảm ứng bởi cytokinin nhưng chồi không xuất hiện cho đến khi khúc cắt được chuyển sang môi trường giảm hoặc không có cytokinin Cytokinin cần cho giai đoạn cảm ứng tạo chồi nhưng kìm hãm sự kéo dài của chồi Những vấn đề này có thể khắc phục bằng

cách giảm nồng độ chất điều hòa sau một hoặc vài lần cấy chuyền để chồi được

Tuy vậy, việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng có sẵn trong tự nhiên như cytokinin có trong nước dừa, dịch chiết khoai tây, chuối; auxin có trong hoa mười giờ cũng mang lại rất nhiều kết quả cao trong nuôi cấy in vitro và còn đảm bảo mức độ an toàn trong các sản phẩm tạo thành, đó là điều rất cần trong nền công

I.3.4 Sự phát sinh rễ bất định trong nuôi cấy mô

Rễ bất định là những rễ thông thường ở thực vật có mạch và được tạo ra ở nhiều vùng trên cơ thể thực vật như đốt, nhánh phụ, lá Rễ bất định có thể mọc ra từ mô của thân trong điều kiện môi trường stress hay bị vết thương cơ học hoặc trong môi trường tái sinh chồi Sự tạo rễ bất định là một bước ngoặt quan trọng trong nuôi cấy những cây thuốc quý, gỗ quý, những cây lương thực, thực phẩm Có ít nhất hai con đường hình thành rễ bất định: từ những tế bào có khả năng tạo cơ quan như tế bào tượng tầng hay từ mô sẹo

Sự hình thành rễ bất định được điều hòa bởi nhiều nhân tố môi trường và các yếu tố nội sinh Auxin và ethylen được xem là hai hormone kích thích sự hình thành rễ bất định trong khi cytokinin và gibberelin thì ngược lại

Sự hình thành rễ bất định từ một đoạn thân bao gồm hai giai đoạn:

- Giai đoạn tái phân chia của mô phân sinh bên tức là một số tế bào xảy ra sự phản phân hóa mạch ở vùng xuất hiện rễ tạo nên một đám tế bào lộn xộn đó là mầm mống của rễ

Giai đoạn phản phân hóa xảy ra như sau: lúc đầu, không bào còn to, lạp thể và ti thể phân cắt mạnh, càng lúc càng nhỏ, tế bào trở nên giống tế bào mô phân sinh cấp hai; sau đó tế bào chất đậm đặc dần, không bào phân chia, nhân và hạch nhân to ra Sau giai đoạn này thì tế bào có đặc tính của tế bào vùng mô phân sinh cấp một có khả năng phân chia cơ quan Tiếp theo, các tế bào có sự phát triển mạnh hoạt tính phân chia để tạo thành khối mô phân sinh nhỏ Sự phân chia tăng lên tạo thành mô sẹo hay vùng phát sinh hình thái chứa các tế bào mô phân sinh cấp một

- Giai đoạn thứ hai là sự sinh trưởng và kéo dài của rễ, rễ thoát khỏi vỏ ra ngoài

I.3.5 Sự kháng oxy hóa

I.3.5.1 Khái niệm về gốc tự do

Oxy được xem như một nguyên tố quan trọng giúp con người duy trì sự sống, chúng tham gia vào quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lượng cung cấp cho mọi hoạt động sống của con người

Khoảng vài thập niên gần đây, các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do Các gốc tự do có nguồn gốc oxy này có hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi chung là gốc dạng oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species)

-),

H2O2[30]

Các dạng oxy hoạt động này do có năng lượng cao, kém bền nên dễ dàng phản ứng với những đại phân tử như protein, lipid, DNA gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là phản ứng dây truyền, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể

Gốc tự do được tạo ra bằng nhiều cách Nó có thể là sản phẩm của những căng thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể xác, mệt mỏi, ô nhiễm môi trường, thuốc lá, dược phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiều

I.3.5.2 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể

Không phải là gốc tự do nào cũng có hại đối với cơ thể Nếu được kiểm soát, nó là ngồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất màu melamine cần cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngăn ngừa nhiễm trùng, tăng cường miễn dịch, làm dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co bóp cơ thịt (Lester, 1999)

I.3.5.3 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể

Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày Nếu không được kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như: ung thư, xơ vữa động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận ở người cao niên, phá rách màng tế bào khiến chất dinh dưỡng thất thoát, tế bào không tăng trưởng rồi chết Chúng tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay Ngoài ra, chúng còn tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử protein, đường bột, lipid, enzyme trong tế bào, gây đột biến ở gene, ở DNA, RNA, làm chất collagen và elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc

Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo chu trình sau đây: Trước

hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí rồi gốc tự do tấn công các ty thể, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng Sau cùng bằng cách oxy hóa gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzyme khiến cơ thể không tăng trưởng được

Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng góp phần và có thể là nguy cơ gây tử vong Hóa già được coi như một tích tụ những thay đổi trong mô và tế bào Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật Ông cho là gốc tự do phản ứng lên ty thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lượng

Các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS) sẽ được loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể như enzyme superoxide dismutase (SOD), enzyme glutathione peroxidase (GSP-Px), enzyme catalase (CAT)… để tạo sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa trong cơ thể con người Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội mô (homeostasis) Trạng thái sinh lí này gọi là stress oxy hóa (oxidative stress) Hay nói cách khác stress oxy hóa là sự rối loạn giữa các chất chống oxy hóa và các chất oxy hóa theo hướng tạo ra nhiều các chất oxy hóa

Ngày nay, do ảnh hưởng của điều kiện sống như: ô nhiễm môi trường, tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy hoạt động Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn thương cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y Do đó cần có những tác dụng tốt, có lợi cho sức khỏe của con người Bên cạnh đó, chúng ta cũng cần khảo sát them những quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ưu và dễ thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu

I.3.5.4 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH

Năm 1922, Golschmidt và Rem đã phát hiện ra một gốc tự do bền có màu tím đậm, hầu như không phân hủy, không nhị trùng hóa và cũng không phản ứng với oxy đó

chính là gốc tự do DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) DPPH không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ Dung dịch DPPH có cực đại hấp thu tại 517 nm, sản phẩm khử của nó là 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine DPPH -H) có màu vàng

Phương pháp này rất hữu hiệu được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và ổn định

Nguyên tắc

DPPH là một góc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thụ tại 517 nm Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt

Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất kháng oxy hóa được minh họa bằng phản ứng được mô tả bên dưới:

Hình 1.3: Phản ứng trung hòa gốc DPPH

II.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây Cà gai leo được cấy chuyền trong môi trường MS trong 6 tuần, chọn các cây kích thước đều nhau, khỏe và không bị nhiễm nấm hay vi khuẩn Cắt đoạn thân thành các đoạn ngắn khoảng 1-1,5 cm, có mang chồi nách

II.2.2 Điều kiện nuôi cấy in vitro cây Cà gai leo II.2.2.1 Môi trường nuôi cấy

Sử dụng môi trường nuôi cấy MS cơ bản, bổ sung một số thành phần: - Đường: 30 g/L

- Agar con cá cơ sở Hiệp Long: 8 g/L

- Dịch chiết Hoa mười giờ cho thí nghiệm tạo rễ với các nồng độ thay đổi pH: 5,7-5,8

Sử dụng chai thủy tinh 500 ml, cho vào mỗi chai 40 ml môi trường, được hấp khử

II.2.2.2 Điều kiện nuôi cấy

II.2.2.3 Hóa chất dùng trong thí nghiệm

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), solasodine (>95%) Hóa chất pha môi trường nuôi cấy thực vật MS Vitamin Morel

Chất điều hòa tăng trưởng thực vật: 3-Indol-acetic acid (IAA)

II.2.2.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Lò vi sóng, tủ cấy, nồi hấp, máy đo pH, cân kỹ thuật, bộ soxhlet, bếp điện, nồi inox, chai thủy tinh 500 ml, dao cắt, kẹp, đèn cồn,

II.3 Thí nghiệm

- Mục đích: + Khảo sát khả năng tạo rễ tốt nhất từ đoạn thân Cà gai leo trong môi trường có bổ sung nồng độ khác nhau của dịch chiết Hoa mười giờ

+ Tạo nguồn vật liệu để thực hiện thí nghiêm tách chiết dịch từ rễ bất định Cà gai leo

- Vật liệu thí nghiệm: Đoạn thân Cà gai leo - Môi trường nuôi cấy:

Môi trường khảo sát: MS bổ sung dịch chiết Hoa mười giờ 100%

- Mô tả thí nghiệm: Bổ sung vào môi trường nuôi cấy dịch chiết 100% của cây Hoa mười giờ để thay thế hợp chất điều hòa sinh trưởng tổng hợp là auxin, cấy đoạn thân Cà gai leo vào bình môi trường, mỗi nghiệm thức 5 bình, mỗi bình 4 mẫu

- Thời gian theo dõi: 8 tuần

- Chỉ tiêu đánh giá: Số lượng, chiều dài và khối lượng rễ tạo thành