BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI SINH Ở LÚA IR64 VÀ MTL250 (Oryza sativa L.) CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS TRẦN THỊ XUÂN MAI VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Năm 2009 SINH VIÊN THỰC HIỆN ĐỖ HOÀNG ĐĂNG KHOA MSSV: 3052836 LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC K31 LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cần Thơ, Ban Chủ Nhiệm Khoa Khoa Học, Ban Giám Đốc Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học tạo điều kiện cho thực đề tài Xin chân thành cảm ơn tất quý thầy cô tận tình giảng dạy, bảo, truyền đạt kiến thức cho suốt trình học Xin chân thành cảm ơn ThS Trần Thị Xuân Mai tận tình hướng dẫn, bổ sung nhiều kiến thức bổ ích tạo điều kiện cho hoàn thành luận văn Xin gửi lời cảm ơn đến Cô Nguyễn Thị Liên, Cô Nguyễn Thị Pha giúp đỡ suốt trình làm luận văn Cảm ơn tất bạn lớp Công nghệ sinh học K.31 nhiệt tình động viên, giúp đỡ, trao đổi đóng góp ý kiến cho Xin chân thành cảm ơn Cha Mẹ, người sinh thành, nuôi dưỡng, giúp đỡ, động viên, chia sẻ khó khăn tạo điều kiện tốt giúp học tập thực đề tài Tháng năm 2009 Đỗ Hoàng Đăng Khoa Luận văn tốt nghiệp Công nghệ Sinh học K31 MỤC LỤC Tiêu đề Trang PHẦN I GIỚI THIỆU PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU I SƠ LƯỢC VỀ HAI GIỐNG LÚA IR64 VÀ MTL250 Giống IR64 a) Đặc tính nông học b) Phẩm chất phản ứng sâu bệnh Giống MTL250 a) Đặc điểm nông học suất b) Phẩm chất phản ứng sâu bệnh II NUÔI CẤY MÔ VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY MÔ Nuôi cấy mô Các yếu tố ảnh hưởng đến trình nuôi cấy mô a) Điều kiện vô trùng nuôi cấy mô b) Môi trường nuôi cấy c) Điều kiện ủ chiếu sáng 16 III NUÔI CẤY MÔ LÚA 17 Vật liệu nuôi cấy 17 Sự phát triển phôi lúa 18 Các loại môi trường nuôi cấy mô lúa 18 a) Môi trường tạo mô sẹo 18 b) Môi trường tái sinh chồi 19 Điều kiện ủ chiếu sáng nuôi cấy mô 19 PHẦN III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 I PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 21 Nguyên liệu hóa chất 21 a) Nguyên liệu 21 b) Hóa chất 21 Thiết bị dụng cụ 21 a) Thiết bị 21 b) Dụng cụ 21 II THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN 21 1.Thời gian 21 2.Địa điểm 21 III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 Vô trùng mẫu cấy 22 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng nhiệt độ lên phát triển mô sẹo 23 a) Tiến hành thí nghiệm 23 b) Ghi nhận kết 23 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng điều kiện ánh sáng lên phát triển mô sẹo 23 a) Tiến hành thí nghiệm 23 b) Ghi nhận kết 23 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng đường maltose lên phát triển mô sẹo 23 a) Tiến hành thí nghiệm 23 b) Ghi nhận kết 23 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng môi trường cấy chuyền đến khả tái sinh mô sẹo 23 a) Tiến hành thí nghiệm 23 b) Ghi nhận kết 24 Tạo chồi tạo rễ 24 Xử lý số liệu 24 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 I Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng nhiệt độ lên phát triển mô sẹo 25 II Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng điều kiện ánh sáng lên phát triển mô sẹo 27 Luận văn tốt nghiệp Công nghệ Sinh học K31 III Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng đường maltose lên phát triển mô sẹo 29 IV Thí Nghiệm 4: Ảnh hưởng môi trường cấy chuyền đến khả tái sinh mô sẹo 30 V Tạo chồi tạo rễ 32 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 I KẾT LUẬN 33 II.ĐỀ NGHỊ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC 37 DANH SÁCH HÌNH Tiêu đề Trang Hình 1: Cấu trúc hình cầu 25 Hình 2: Biểu đồ tỷ lệ tạo mô sẹo mô có chất lượng tốt giống IR64 26 Hình 3: Biểu đồ tỷ lệ tạo mô sẹo mô có chất lượng tốt giống MTL250 26 Hình 4: Biểu đồ tỷ lệ tạo mô sẹo mô có chất lượng giống IR64 27 Hình 5: Biểu đồ tỷ lệ tạo mô sẹo mô có chất lượng tốt giống MTL250 28 Hình 6: Hiện tượng tiết phenol môi trường CIM-J3 điều kiện có ánh sáng 31 Hình 7: Mô có chất lượng tốt giai đoạn cấy chuyền 32 Hình 8: Mô sẹo tạo chồi 32 Hình 9: Tạo rễ 32 DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Tỷ lệ mô sẹo mô có chất lượng tốt hai giống IR64 MTL250 điều kiện môi trường ánh sáng 29 Bảng 2: Kết thí nghiệm ảnh hưởng môi trường cấy chuyền 31 BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid BAP Benzylaminopurine CEH Casein enzyme hydrolase CIM Callus induction medium ĐBSCL Đồng sông Cửu Long MS Murashige and Skoog NAA α-napthaleneacetic acid Luận văn tốt nghiệp Công nghệ Sinh học K31 TÓM LƯỢC Hai giống lúa MTL250 IR64 sử dụng nghiên cứu để theo dõi điều kiện nuôi cấy kết hợp thành phần môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả tái sinh dòng lúa indica Giống MTL250 có tỷ lệ hình thành mô sẹo tốt hai điều kiện sáng liên tục tối hoàn toàn, giống IR64 có đáp ứng tốt điều kiện tối hoàn toàn Nhiệt độ 320C thích hợp cho trình hình thành mô sẹo chất lượng mô cho hai giống lúa Sự kết hợp đường maltose nồng độ 3% vào môi trường kích thích mô sẹo có ảnh hưởng tốt lên khả tạo mô sẹo tỷ lệ mô có cấu trúc hình cầu, chặt khô Trong giai đoạn cấy chuyền, mô sẹo tuần tuổi nuôi cấy môi trường CIM-J3 điều kiện tối cho kết tốt cho trình nhân sinh khối biệt hóa mô sẹo PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam quốc gia có nông nghiệp lâu đời lúa lương thực quan trọng có diện tích canh tác 4,13 triệu Không Việt Nam, lúa nguồn thực phẩm gần nửa dân số giới (Shimamoto, 1995) Cây lúa thuộc hai loài: Oryza sativa lúa trồng Châu Á Oryza glaberima lúa trồng Châu Phi Hai dòng Oryza sativa O.japonica O.indica Ở Việt Nam, đồng sông Cửu Long mệnh danh vựa lúa Việt Nam có diện tích canh tác lúa chiếm 40% sản lượng lúa chiếm 50% so với nước (Nguyễn Thị Lang, 2000) Những năm vừa qua, sóng công nghiệp hoá- đại hoá đất nước, nhiều diện tích đất nông nghiệp chuyển đổi thành khu công nghiệp, nhà máy, chung cư lẽ mà diện tích đất phục vụ cho nông nghiệp ngày bị thu hẹp Theo Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, năm 2006, tổng diện tích đất trồng lúa nước 4,13 triệu ha, giảm 316.000 so với năm 2000 Các vùng giảm mạnh đồng sông Cửu Long với 175.000 ha, Đông Nam Bộ giảm 51.000 ha, đồng sông Hồng giảm 36.000 Bên cạnh đó, tình hình bất lợi biến đổi khí hậu toàn cầu gia tăng thiên tai hạn hán, lũ lụt, xâm nhập mặn…gây ảnh hưởng đến suất trồng lúa người dân Nhu cầu giống lúa có suất cao, khả chống chịu tốt với thời tiết sâu bệnh cần thiết để đảm bảo an ninh lương thực quốc gia đáp ứng nhu cầu xuất gạo Để thực nhu cầu đó, phải phát triển công nghệ sinh học phân tử thực vật để tạo giống tốt sản xuất nhanh nguồn giống Nuôi cấy mô giai đoạn quan trọng định thành công công nghệ sinh học thực vật Không phải tất loài thực vật đáp ứng môi trường nuôi cấy Các giống lúa có môi trường nuôi cấy riêng cho giống khác So với O.japonica O.indica có khả tái sinh nuôi cấy in vitro thấp (Kyozuca ctv.,1988) Ở đồng sông Cửu Long, phần lớn giống lúa thuộc dòng Oryza indica, để nghiên cứu sâu Luận văn tốt nghiệp Công nghệ Sinh học K31 giống lúa cần tìm môi trường nuôi cấy thích hợp cho dòng Oryza indica Mục tiêu đề tài tập trung vào khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả tái sinh hai giống lúa IR64 MTL250 làm tiền đề cho thí nghiệm khác hai giống lúa PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU I SƠ LƯỢC VỀ HAI GIỐNG LÚA IR64 VÀ MTL250 Giống IR64 Giống lúa IR 64 có nguồn gốc từ Viện Lúa Quốc tế (IR18348-36-3-3) khảo nghiệm đồng sông Cửu Long từ năm 1983 với tên gọi OM89, công nhận giống vào ngày 29 tháng năm 1985 Hội Đồng Giống quốc gia Philippines, với tên gọi IR64, công nhận giống quốc gia Việt Nam năm 1987 Giống IR 64 ba giống có tính thích nghi rộng theo kết qủa chương trình INGER năm 1996 (trong có giống OM576 Việt Nam) Đây giống lai tạo IRRI theo chiến lược đa dạng nguồn gen kháng với loại sâu bệnh hại stress sinh học Trong trình phát triển ĐBSCL, có tên IR64B IR64NC (nguyên chủng) Có thể nói sau IR42, giống lúa IR64 có mức độ ổn định sản xuất lâu dài từ trước đến nay, với ưu điểm suất cao, chống chịu ổn định với sâu bệnh hại chính, giống cao sản có phẩm chất gạo hàng đầu, giống hội đủ hai tiêu chuẩn hàm lượng amylose trung bình, độ trở hồ trung bình IR64 chọn giống phát triển vùng lúa xuất triệu Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn a) Đặc tính nông học Giống lúa IR64 có thời gian sinh trưởng thuộc nhóm A2 (105-110 ngày) Chiều cao 90-95 cm độ dài 24-25cm So với giống khác, IR64 có số bụi trung bình (10.9 bông) Số hạt 78.3 hạt Tuy nhiên số vùng đất phì nhiêu số hạt đạt tới 92.5 hạt Tỷ lệ hạt lép vụ Đông Xuân khoảng 14.2% vụ Hè thu cao (IR64 không thích hợp cho vụ Hè thu) Khả thụ phấn mùa mưa so với OMCS94 OM1723 Trọng lượng 1000 hạt đạt 25,0-27,2 gr, IR64 xếp nhóm hạt to Xét số thu hoạch (HI), IR64 có giá trị HI tương đối cao, đạt 0.56 Năng suất IR64 có tiềm lớn vụ đông xuân, thường cho suất thấp lợi nghiên cứu xa khả chuyển gen vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens Do đó, điều kiện nhiệt độ 320C chọn cho thí nghiệm II Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng điều kiện ánh sáng lên phát triển mô sẹo Dựa kết thí nghiệm 1, thí nghiệm tiến hành nhiệt độ 32 C với hai điều kiện ánh sáng: chiếu sáng liên tục để tối hoàn toàn Theo biều đồ (Hình 4), giống IR64 có tỷ lệ hình thành mô sẹo điều kiện tối (81.90%) cao có ánh sáng (72.44%) khác biệt ý nghĩa Trong có khác biệt đáng kể tỷ lệ mô có chất lượng tốt hai điều kiện ánh sáng với tỷ lệ 70.47% tối 51.36% có ánh sáng Hình 4: Biểu đồ tỷ lệ tạo mô sẹo mô có chất lượng tốt giống IR64 Đối với giống MTL250, tỷ lệ hình thành mô sẹo mô có chất lượng tốt điều kiện chiếu sáng (91% 80%) cao điều kiện tối hoàn toàn (90.05% 73.50%) khác biệt ý nghĩa mặt thống kê 27 Luận văn tốt nghiệp Công nghệ Sinh học K31 Hình 5: Biểu đồ tỷ lệ tạo mô sẹo mô có chất lượng tốt giống MTL250 Trong thí nghiệm ảnh hưởng ánh sáng lên hình thành mô sẹo giống RD6, Pipatpanukul cộng (2004) kết luận điều kiện chiếu sáng có hiệu tốt hình thành mô so với điều kiện ánh sáng Năm 2005, Maneewan cộng kết luận khả hình thành mô sẹo cao kích thước trung bình mô sẹo điều kiện chiếu sáng cao lớn so với điều kiện tối hoàn toàn nghiên cứu giống lúa Chinat1 Cũng khảo sát ảnh hưởng điều kiện ánh sáng lên số giống lúa thuộc dòng indica, Abayawickrama Anai (2006) cho thấy khác biệt điều kiện sáng tối lên khả tạo mô sẹo giống lúa, có giống Ladywright có tỷ lệ mô sẹo điều kiện sáng cao điều kiện tối Qua thí nghiệm cho thấy khác biệt điều kiện ánh sáng lên khả hình thành mô sẹo hai giống lúa Đối với giống MTL250 khác biệt đáng kể khả tạo mô có chất lượng tốt giống IR64 tỷ lệ mô có chất lượng tốt điều kiện tối khác biệt có ý nghĩa so với điều kiện có ánh sáng 28 III Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng đường maltose lên phát triển mô sẹo Kết phân tích (bảng 1) cho thấy có khác biệt có ý nghĩa hai loại môi trường tạo mô sẹo Cả hai giống lúa có tỷ lệ mô sẹo mô có chất lượng tốt cao môi trường tạo mô sẹo có kết hợp với đường maltose Trong đó, điều kiện ánh sáng không ảnh hưởng đáng kể lên hình thành mô chất lượng môi trường CIM3% maltose Kết thí nghiệm cho thấy giống MTL250 có khả hình thành mô sẹo mô có chất lượng cao giống IR64 môi trường CIM3% maltose Bảng 1: Tỷ lệ mô sẹo mô có chất lượng tốt hai giống IR64 MTL250 điều kiện môi trường ánh sáng IR64 MTL250 Tỷ lệ mô có Tỷ lệ mô có Môi trường Tỷ lệ mô sẹo Tỷ lệ mô sẹo chất lượng tốt chất lượng tốt CIM sáng 43.50c 31.50c 70.50b 51.50b CIM tối 54.50b 46.00b 66.00b 45.00b CIM3% sáng 72.00a 59.00a 85.50a 70.00a CIM3% tối 71.50a 58.50a 80.00a 66.50a Trên cột giá trị trung bình theo sau chữ khác biệt ý nghĩa 5% Kết tương tự kết luận Lin Qifa Zhang (2005) nghiên cứu ảnh hưởng môi trường khác lên hiệu chuyển gen giống lúa thuộc dòng indica cho thấy sử dụng đường maltose môi trường có hiệu cao so với đường sucrose Tương tự, Zaidi cộng (2006) báo cáo ảnh hưởng loại đường lên khả hình thành mô sẹo, hình thành cấu trúc hình cầu khả tạo chồi giống MDU5 Kết cho thấy môi trường sử dụng đường maltose có tỷ lệ tạo mô sẹo, tạo cấu trúc hình cầu khả tạo chồi cao so với môi trường sử dụng đường glucose sucrose Qua thí nghiệm cho thấy môi trường tạo sẹo sử dụng kết hợp đường maltose có ảnh hưởng tốt so với đường sucrose lên hình thành mô sẹo chất lượng mô hai điều kiện sáng tối 29 Luận văn tốt nghiệp Công nghệ Sinh học K31 IV Thí Nghiệm 4: Ảnh hưởng môi trường cấy chuyền đến khả tái sinh mô sẹo Cấy chuyền tiến trình chuyển vật liệu cấy mô phân chia lần đầu sang môi trường giống khác với môi trường nuôi cấy ban đầu nhằm mục đích mô phát triển cung cấp thêm dinh dưỡng để tăng thêm sinh khối biệt hóa tốt Chính môi trường cấy chuyền nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu tái sinh Trong thí nghiệm này, mô sẹo nuôi môi trường CIM3% maltose sau tuần chuyển sang hai môi trường môi trường CIM3% maltose ban đầu môi trường CIM-J3 (Xem phụ lục) hai điều kiện sáng tối Theo bảng phân tích (bảng 2), môi trường CIM-J3 điều kiện tối có tỷ lệ mô đạt chất lượng tốt cao môi trường CIM3% maltose Ở giống IR64 tỷ lệ mô tốt môi trường CIM-J3 điều kiện tối có tỷ lệ cao (48.21%) khác biệt có ý nghĩa môi trường CIM3% maltose điều kiện Trong đó, điều kiện có ánh sáng tỷ lệ mô tốt môi trường CIM-J3 (30.36%) thấp môi trường CIM3% maltose hai điều kiện ánh sáng Điều cho thấy ánh sáng có ảnh hưởng lên trình phát triển mô giai đoạn Giống MTL250 có kết tương tự giống IR64, thí nghiệm trước cho thấy điều kiện ánh sáng có ảnh hưởng tốt lên phát triển mô MTL250 giai đoạn cấy chuyền kết thí nghiệm cho thấy môi trường CIM-J3 điều kiện tối có tỷ lệ mô tốt (34.38%) cao môi trường điều kiện ánh sáng khác Tỷ lệ mô tốt điều kiện chiếu sáng môi trường CIM-J3 thấp điều kiện lại Bên cạnh đó, điều kiện có ánh sáng có tượng tiết phenol mô lúa môi trường CIMJ3 (hình 6) Hiện tượng ánh sáng với thành phần môi trường CIM-J3 kích thích mô tiết phenol 30 Bảng 2: Kết thí nghiệm ảnh hưởng môi trường cấy chuyền IR64 Tỷ lệ mô có chất lượng tốt 30.36b MTL250 Tỷ lệ mô có chất lượng tốt 21.88b CIM-J3 tối 48.21a 34.38a CIM3% sáng 30.95b 25.00b CIM3% tối 41.67ab 28.13ab Môi trường CIM-J3 sáng Trên cột giá trị trung bình theo sau chữ khác biệt ý nghĩa 5% Hình 6: Hiện tượng tiết phenol môi trường CIM-J3 điều kiện có ánh sáng Qua thí nghiệm cho thấy ánh sáng có ảnh hưởng giai đoạn cấy chuyền môi trường CIM-J3 điều kiện tối hoàn toàn có tỷ lệ mô đạt chất lượng cao hai giống lúa Kết tương tự báo cáo Lin Qifa Zhang (2005) kết luận môi trường CIM-J3 môi trường thích hợp cho giai đoạn cấy chuyền cho dòng lúa indica 31 Luận văn tốt nghiệp Công nghệ Sinh học K31 V Tạo chồi tạo rễ Các mô đạt chất lượng thí nghiệm (hình 7) chuyển sang môi trường tạo chồi tạo rễ Kết cho thấy mô có khả tạo chồi tạo rễ (hình hình 9) Hình 7: Mô có chất lượng tốt giai đoạn cấy chuyền Hình 8: Mô sẹo tạo chồi Hình 9: Tạo rễ 32 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I KẾT LUẬN - Nhiệt độ 320C thích hợp cho trình hình thành mô sẹo chất lượng mô hai giống IR64 MTL250 - Ánh sáng ảnh hưởng rõ lên trình hình thành mô chất lượng mô giống MTL250 Đối với giống IR64, điều kiện tối cho kết tốt - Môi trường tạo sẹo có kết hợp với đường maltose cho kết tốt môi trường kết hợp với đường sucrose không phụ thuộc vào điều kiện ánh sáng - Môi trường CIM-J3 điều kiện tối thích hợp cho giai đoạn cấy chuyền mô hai giống lúa ĐỀ NGHỊ II - Tiếp tục tìm thêm số nhân tố khác ảnh hưởng lên khả hình thành mô sẹo hai giống lúa IR64 MTL250 - Nghiên cứu thêm yếu tố ảnh hưởng đến khả tạo chồi hai giống lúa 33 Luận văn tốt nghiệp Công nghệ Sinh học K31 TÀI LIỆU THAM KHẢO - A.H Kabir, Istiak Mahfuz, M.A Razvy, M Bulbul Ahmed and M.F Alam, 2008, Indirect Organogenesis and Somaclonal Variation in Four Rice Cultivars of Bangladesh, Journal of Applied Sciences Research, 4(4): 451458 - A.S.M.T Abayawickrama and Toyoali Anai, 2006,Comparison of Regeneration Efficiency of Different Genotypes of Indica Rice Cultivars, Bull.Fac Agr., Saga University - Bùi Bá Bổng, 1995, Nhân giống nuôi cấy mô, Nhà xuất Sở Khoa Học Công Nghệ An Giang P32-p50 - Datta SK, Torrizo LB, Tu J, Oliva N, Datta K (1997) Production and molecular evaluation of transgenic rice plants IRRI Discussion Paper Series No: 21 - Haifeng Qian, Xianyin Zhang and Qingzhong Xue, 2004, Factors Affecting the Callus Induction and GUS Transient Expression in Indica Rice Pei’ai64s, Pakistan Journal of Biological Science (4), p615-619 - Huỳnh Thị Hồng Mai, 2005, Cải thiện quy trình nuôi cấy mô dòng lúa INDICA hai giống IR64 MTL250, Luận văn tốt nghiệp Đại Học, Khoa Khoa Học, Đại Học Cần Thơ - Kedsukon Maneewan , Sumontip Bunnag , Piyada Theerakulpisut , Manit Kosittrakun and Anawat Suwanagul, 2005, Transformation of rice (Oryza sativa L.) cv Chainat using chitinase gene, Songklanakarin J Sci Technol., 2005, 27(6) : 1151-1162 - Lin YJ, Zhang Q (2005) Optimizing the tissue culture condition for high efficiency transformation of indica rice Plant Cell Rep 23: 540–547 - M.A.Zaidi M.Narayanan, R.Sardana, I.Taga, S.Postel, R ohns, M McNulty, Y Mottiar, J Mao, E Loit, I Altosaar, 2006, Optimizing tissue culture media for efficient transformation of different indica rice genotypes, Agronomy Research 4(2), 563-575 34 - Md Monirul Islam, Mahatalat Ahmed and Debabrata Mahaldar, 2005, In Vitro Callus Induction and Plant Regeneration in Seed Explants of Rice (Oryza Sativa L.), Research Journal of Agriculture and Biological Sciences 1(1): 72-75 - Nguyễn Bảo Toàn, 2005, Giáo trình Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Tủ sách Đại Học Cần Thơ - Nguyễn Đức Thành, 2000, Nuôi cấy mô tế bào thực vật – nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông nghiệp - Nguyễn Thị Lang, 2000, Giống lúa sản xuất hạt giống lúa tốt, Nhà xuất Bản Nông nghiệp, p27-p54 - Pipatpanukul, T., Bunnag, S, Theerakulpisut, P and Kosittrakul, M., 2004, Transformation of indica rice (Oryza sativa L.) cv RD6 mediated by Agrobacterium tumefaciens, Songklanakarin J Sci Technol., 26(1) : 1-13 - P T Lynch, R P Finch, M R Davey, E C Cocking, 1991, Rice Tissue Culture and its Application, Plant Genetic Manipulation Group, Department of Botany, University of Nottingham, UK - Shin-ichiro Kawata and Aiya Ishihara, 1968, The Regeneration of Rice Plant, Oryza sativa L., in the Callus Derived from the Seminal Root, Faculty of Agriculture, University of Tokyo - S.M Saqlan Naqvi, Tasawar Sultana, Tayyaba Yasmin, Tariq Mahmood and M Shaheen Akhtar, 2006, Efficient Embryogenic System from Tissue Culture of Mature Embryos for some Coarse Varieties of Rice (Oryza sativa L.) Pak J Bot., 38(4): 969-975 - S M Saqlan Naqvi, Razia Sultana and Hamid Rashid, 2005, Tissue culture studies inOryza sativa L.cvs Basmati 385 and Super Basmati, Pak J Bot.,37(4) - Thadavong, S., Sripichitt, P., Wongyai, W and Jompuk, P 2002 Callus induction and plant regeneration from mature embryos of glutinous rice (Oryza sativa L.) cultivar TDK1 Kasetsart J (Nat Sci.) 36: 334-344 35 Luận văn tốt nghiệp Công nghệ Sinh học K31 - Totik Sri Mariani, Hiroshi Miyake and Yoji Takeoka, 1998, Changes in Surface Structure during Direct Somatic Embryogenesis in Rice Scutellum Observed by Scanning Electron Microscopy, Plant Production science Vol.1, p223-231 - Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, 2007, Công nghệ Sinh học, tập 2: Công nghệ sinh học tế bào, Nhà Xuất Bản Giáo Dục, p22-p27 36 PHỤ LỤC THÍ NGHIỆM Bảng kiểm định T-TEST giống IR64 *Tỷ lệ hình thành mô sẹo Nghiệm thức : 280C Nghiệm thức : 320C Trung bình: 60.500 Trung bình: 49.000 Độ lệch chuẩn: 4.0995 Giá trị t : 2.8052 Độ tự do: 18 Probability of t: 0.0117 Kết quả: Bác bỏ giả thuyết – hai trung bình khác biệt có ý nghĩa *Tỷ lệ mô có chất lượng tốt Nghiệm thức : 280C Nghiệm thức : 320C Trung bình: 39.5 Trung bình: 41.5 Độ lệch chuẩn: 3.6893 Giá trị t : -0.5421 Độ tự do: 18 Probability of t: 0.0117 Kết quả: Chấp nhận giả thuyết – hai trung bình không khác biệt Bảng kiểm định T-TEST giống MTL250 *Tỷ lệ hình thành mô sẹo Nghiệm thức : 280C Nghiệm thức : 320C Trung bình: 95.000 Trung bình: 96.000 Độ lệch chuẩn: 2.0817 Giá trị t : -0.4804 Độ tự do: 18 Probability of t: 0.6367 Kết quả: Chấp nhận giả thuyết – hai trung bình không khác biệt *Tỷ lệ mô có chất lượng tốt Nghiệm thức : 280C Nghiệm thức : 320C Trung bình: 37.00 Trung bình: 40.50 Độ lệch chuẩn: 2.1413 Giá trị t : 3.5473 Độ tự do: 18 Probability of t: 0.3369 Kết quả: Chấp nhận giả thuyết – hai trung bình không khác biệt 37 Luận văn tốt nghiệp Công nghệ Sinh học K31 THÍ NGHIỆM Bảng kiểm định T-TEST giống IR64 *Tỷ lệ hình thành mô sẹo Nghiệm thức : Sáng Nghiệm thức : Tối Trung bình: 72.441 Trung bình: 81.898 Độ lệch chuẩn: 5.1141 Giá trị t : -1.8492 Độ tự do: 18 Probability of t: 0.0809 Kết quả: Chấp nhận giả thuyết – hai trung bình không khác biệt *Tỷ lệ mô có chất lượng tốt Nghiệm thức : Sáng Nghiệm thức : Tối Trung bình: 51.362 Trung bình: 70.469 Độ lệch chuẩn: 5.5558 Giá trị t : -3.4391 Độ tự do: 18 Probability of t: 0.0029 Kết quả: Bác bỏ giả thuyết – hai trung bình khác biệt có ý nghĩa Bảng kiểm định T-TEST giống MTL250 *Tỷ lệ hình thành mô sẹo Nghiệm thức : Sáng Nghiệm thức : Tối Trung bình: 91.000 Trung bình: 90.500 Độ lệch chuẩn: 2.8137 Giá trị t : 0.1777 Độ tự do: 18 Probability of t: 0.8609 Kết quả: Chấp nhận giả thuyết – hai trung bình không khác biệt *Tỷ lệ mô có chất lượng tốt Nghiệm thức : Sáng Nghiệm thức : Tối Trung bình: 80.000 Trung bình: 73.500 Độ lệch chuẩn: 5.2202 Giá trị t : 1.2452 Độ tự do: 18 Probability of t: 0.2290 Kết quả: Chấp nhận giả thuyết – hai trung bình không khác biệt 38 THÍ NGHIỆM Bảng phân tích ANOVA giống IR64 *Tỷ lệ hình thành mô sẹo Giá Trị K -7 Tổng Nghiệm thức Môi trường Ánh sáng AxB Sai số Độ tự 1 36 39 Tổng bình phương 5175.625 275.625 330.625 4087.500 9869.375 Trung bình bình phương 5175.625 275.625 330.625 113.542 Tổng bình phương 4000.000 562.500 490.000 3685.000 8737.500 Trung bình bình phương 4000.000 562.500 490.000 102.361 Giá trị F Prob 45.5835 2.4275 2.9119 0.0000 0.1280 0.0965 Giá trị F Prob 39.0773 5.4953 4.7870 0.0000 0.0247 0.0352 CV=17.65% *Tỷ lệ mô có chất lượng tốt Giá Trị K -7 Tổng Nghiệm thức Môi trường Ánh sáng AxB Sai số Độ tự 1 36 39 CV = 20.75% Bảng phân tích ANOVA giống MTL250 *Tỷ lệ hình thành mô sẹo Giá Trị K -7 Tổng Nghiệm thức Môi trường Ánh sáng AxB Sai số Độ tự 1 36 39 Tổng bình phương 2102.500 250.000 2.500 2585.000 4940.000 CV = 11.22% 39 Trung bình bình phương 2102.500 250.000 2.500 71.806 Giá trị F Prob 29.2805 3.4816 0.0348 0.0000 0.0702 Luận văn tốt nghiệp Công nghệ Sinh học K31 *Tỷ lệ mô có chất lượng tốt Giá Trị K -7 Tổng Nghiệm thức Môi trường Ánh sáng AxB Sai số Độ tự 1 36 39 Tổng bình phương 4000.000 250.000 22.500 3155.000 7427.500 Trung bình bình phương 4000.000 250.000 22.500 87.639 Giá trị F Prob 45.6418 2.8526 0.2567 0.0000 0.0999 0.0352 Giá trị F Prob 0.3405 7.8403 0.4895 0.0160 Giá trị F Prob 0.3333 8.3333 3.0000 0.0137 0.1089 CV = 16.07% THÍ NGHIỆM *Tỷ lệ mô có chất lượng tốt giống IR64 Giá Trị K -7 Tổng Nghiệm thức Môi trường Ánh sáng AxB Sai số Độ tự 1 12 15 Tổng bình phương 35.462 816.531 50.980 1249.750 2152.722 Trung bình bình phương 35.462 816.531 50.980 104.146 CV = 27.00% *Tỷ lệ mô có chất lượng tốt giống MTL250 Giá Trị K -7 Tổng Nghiệm thức Môi trường Ánh sáng AxB Sai số Độ tự 1 12 15 Tổng bình phương 9.766 244.141 87.891 351.563 693.359 CV = 19.79% 40 Trung bình bình phương 9.766 244.141 87.891 29.297 THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG *CIM : 4,3g/L MS basal salt mixture (Duchefa); 500mg/L Proline; 500mg/L Glutamine; 300mg/L CEH; 30g/L Sucrose; 2mg/L 2,4-D; 4g/L Phytagel *CIM3% maltose: 4,3g/L MS basal salt mixture (Duchefa); 500mg/L Proline; 500mg/L Glutamine; 300mg/L CEH; 30g/L Maltose; 2mg/L 2,4-D; 4g/L Phytagel *CIM-J3: 100ml/L L3 MacroI (10X); 400mg/L CaCl2.2H2O; 5ml/L L3 Micro (200X); 250µl/L CuSO4+CoCl2 (400X); 10ml/L Fe-EDTA (100X); 2,5ml/L L3 vitamin (400X); 2,5g/L 2,4-D (2mg/ml); 500mg/L Proline; 500mg/L Glutamine; 30g/L Maltose; 4g/L Phytagel *Thành phần L3: *L3 Macro: 1,9g/L KNO3, 1,7g/L NH4NO3; 170mg/L KH2PO4; 370mg/L MgSO4.7H2O; *L3 Micro: 100mg/L MnSO4.4H2O; 20mg/L ZnSO4.7H2O; 30mg/L H3BO3; 7.5mg/L KI; 2.5mg/L Na2MoO4.2H2O *L3 vitamin: 2mg/L Glycine; 1mg/L Thiamine; 1mg/L Pyridoxine; 1mg/L Nicotinic acid; 100mg/L i-Inositol *Môi trường tạo chồi (SIM-B1) 4,4 g/L MS including vitamin (Duchefa); 30g/L Sorbitol; 20g/L Sucrose; 6g/L Phytagel ; 2mg/L BAP, 0,5mg/L NAA (BAP NAA để vào môi trường sau khử trùng) *Môi trường tạo rễ 4,4 g/L MS including vitamin (Duchefa); 50g/L Sucrose; 8g/L Agar Các môi trường có pH=5.8 41 [...]... tạo mô sẹo tốt nhất ở hai giống lúa MTL250 và IR64 với tỷ lệ lần lượt là 46% và 44,7% 18 Nghiên cứu về ảnh hưởng của các nguồn carbonhydrat khác nhau lên khả năng tạo sẹo và tái sinh chồi ở một số dòng lúa Indica, Lin và Qifa Zhang (2005) đã kết luận rằng đường maltose có hiệu quả tốt hơn trong cả môi trường tạo sẹo và môi trường tạo chồi Cũng nghiên cứu về ảnh hưởng của các loại đường, Zaidi và cộng... triển của phôi Các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng nhiều đến sự phát triển của phôi nuôi cấy in vitro Thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ và ánh sáng thấp hơn so với phôi phát triển ngoài tự nhiên Nuôi cấy phôi thường được sử dụng để phá ngủ ở hạt, thử sức sống của hạt và để duy trì những phôi yếu và cứu phôi lai xa (Nguyễn Đức Thành, 2000) 2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình... tố với 10 lần lặp lại ở mỗi môi trường Các dĩa Petri sau khi cấy các hạt gạo sẽ được quấn kín bằng giấy paraffin và đem ủ ở điều kiện nhiệt độ và ánh sáng theo kết quả của thí nghiệm 1 và 2 b) Ghi nhận kết quả Quan sát sự tạo mô sẹo ở các môi trường khác nhau Ghi nhận tỷ lệ tạo mô sẹo và tỷ lệ mô có chất lượng tốt ở mỗi môi trường sau 3 tuần 5 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của các môi trường cấy chuyền đến. .. và mô có chất lượng tốt ở giống MTL250 Chất lượng của mô là một trong những yếu tố quyết định khả năng tái sinh của mô sẹo Cả hai giống lúa MTL250 và IR64 đều có tỷ lệ hình thành mô đạt chất lượng tốt ở 320C cao hơn ở 280C Mặc dù sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê nhưng điều kiện nhiệt độ 280C có thể gây ra một vài bất 26 lợi trong những nghiên cứu xa hơn về khả năng chuyển gen bằng... mô sẹo cao hơn và kích thước trung bình của mô sẹo dưới điều kiện chiếu sáng sẽ cao hơn và lớn hơn so với điều kiện tối hoàn toàn khi nghiên cứu về giống lúa Chinat1 Cũng khảo sát về sự ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng lên một số giống lúa thuộc dòng indica, Abayawickrama và Anai (2006) đã cho thấy không có sự khác biệt giữa điều kiện sáng và tối lên khả năng tạo mô sẹo ở các giống lúa, chỉ có giống... chất lượng tốt ở hai điều kiện ánh sáng với tỷ lệ 70.47% ở trong tối và 51.36% khi có ánh sáng 0 Hình 4: Biểu đồ tỷ lệ tạo mô sẹo và mô có chất lượng tốt ở giống IR64 Đối với giống MTL250, tỷ lệ hình thành mô sẹo và mô có chất lượng tốt ở điều kiện chiếu sáng (91% và 80%) cao hơn ở điều kiện tối hoàn toàn (90.05% và 73.50%) nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê 27 Luận văn tốt nghiệp... thành phần và nồng độ các chất nhưng tất cả các môi trường nuôi cấy đều gồm có các thành phần sau: các chất vô cơ, các vitamin, các acid amin, nguồn carbonhydrate, các chất điều hòa sinh trưởng và các chất tạo môi trường đặc 9 Luận văn tốt nghiệp Công nghệ Sinh học K31 *Các chất vô cơ Thành phần vô cơ bao gồm các muối khoáng được đưa vào môi trường nuôi cấy Nhu cầu về muối khoáng của tế bào và mô thực... của Lin và Qifa Zhang (2005) khi nghiên cứu về ảnh hưởng của các môi trường khác nhau lên hiệu quả chuyển gen trên các giống lúa thuộc dòng indica đã cho thấy rằng sử dụng đường maltose trong các môi trường có hiệu quả cao hơn so với đường sucrose Tương tự, Zaidi và cộng sự (2006) đã báo cáo về ảnh hưởng của các loại đường lên khả năng hình thành mô sẹo, sự hình thành cấu trúc hình cầu và khả năng tạo... sáng cao hơn điều kiện tối Qua thí nghiệm cho thấy không có sự khác biệt giữa các điều kiện ánh sáng lên khả năng hình thành mô sẹo ở cả hai giống lúa Đối với giống MTL250 cũng không có sự khác biệt đáng kể về khả năng tạo mô có chất lượng tốt nhưng giống IR64 thì tỷ lệ mô có chất lượng tốt ở điều kiện tối khác biệt có ý nghĩa so với điều kiện có ánh sáng 28 III Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của đường maltose... 300C Kabir và cộng sự (2008) đã tiến hành thí nghiệm khảo sát quá trình tạo sẹo trong điều kiện tối hoàn toàn ở nhiệt độ 25-260C và thực hiện tái sinh chồi trong điều kiện chiếu sáng 14 giờ ở nhiệt độ 24-260C Kết quả tạo sẹo của thí nghiệm đạt tỷ lệ 86,11% và 85,33% tỷ lệ mô tái sinh chồi ở giống BRRI-28 20 PHẦN III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 1 Nguyên liệu và hóa chất: ... văn tốt nghiệp Công nghệ Sinh học K31 giống lúa cần tìm môi trường nuôi cấy thích hợp cho dòng Oryza indica Mục tiêu đề tài tập trung vào khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả tái sinh hai giống lúa. .. chất phản ứng sâu bệnh II NUÔI CẤY MÔ VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY MÔ Nuôi cấy mô Các yếu tố ảnh hưởng đến trình nuôi cấy mô a) Điều kiện vô... hình thành mô sẹo hai giống lúa IR64 MTL250 - Nghiên cứu thêm yếu tố ảnh hưởng đến khả tạo chồi hai giống lúa 33 Luận văn tốt nghiệp Công nghệ Sinh học K31 TÀI LIỆU THAM KHẢO - A.H Kabir, Istiak