ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM HUỲNH NGỌC OANH NGHIÊN CỨU Q TRÌNH CỐ ĐỊNH VÀ CÁC ĐẶC TÍNH CỦA MỘT SỐ ENZYME PHÂN GIẢI POLYSACCHARIDE Chuyên ngành: Hóa Sinh Mã số: 62 42 30 15 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Đồng Thò Thanh Thu TP Hồ Chí Minh – Năm 2010 i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Những kết nghiên cứu hoàn toàn chưa công bố tác giả khác Huỳnh Ngọc Oanh ii Lời cảm ơn Luận án hoàn thành nhờ vào giúp đỡ của: PGS.TS Đồng Thò Thanh Thu – Bộ môn Sinh Hoá, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh giảng dạy, truyền dạt kiến thức suốt thời gian học tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, đóng góp nhiều ý kiến quý báu, trình làm luận án PGS.TS Nguyễn Đức Lượng – chủ nhiệm môn Công nghệ Sinh học Trường Đại học Bách khoa TPHCM – tạo điều kiện thuận lợi, động viên góp nhiều ý kiến giúp hoàn thành tốt luận án PGS.TSKH Lưu Duẩn, PGS.TS Phạm Thành Hổ, PGS.TS Phạm Thò Ánh Hồng, PGS.TS Bùi Văn Lệ, PGS.TS Nguyễn Xích Liên, PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn, TS Lê Phi Nga … đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp hoàn thành tốt luận án Ban chủ nghiệm khoa Sinh học, Ban Giám Hiệu, Phòng Sau Đại học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM Ban chủ nghiệm khoa Kỹ thuật Hóa học, Ban Giám Hiệu Trường Đại học Bách khoa tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian làm luận án Các Thầy Cô Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh Hóa Trường Đại học Khoa học Tự nhiên dạy đỗ tận tình truyền đạt cho nhiều kiến thức kinh nghiệm q báu suốt thời gian học giảng đường đại học Các Thầy Cô Bộ môn Công nghệ Sinh học Trường Đại học Bách khoa Tp.HCM tạo điều kiện thuận lợi hỗ trợ suốt thời gian làm luận án Mẹ có công sinh thành dạy dỗ nên người gia đình người cạnh tôi, nguồn động viên tinh thần cho học tập sống Xin nhận biết ơn chân thành sâu sắc NCS Huỳnh Ngọc Oanh iii Mục lục Lời cam đoan .i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình xi Danh mục sơ đồ xv MỞ ĐẦU Chương 1- TỔNG QUAN 1.1- Enzyme cố đònh 1.1.1- Sơ lược enzyme cố đònh 1.1.2- Các phương pháp cố đònh enzyme 1.1.3- Chất mang 14 1.2- Enzyme thủy phân carbohydrate 30 1.2.1- Enzyme - amylase 30 1.2.2- Glucoamylase-GA 32 1.2.3- Cellulase 34 1.2.4- Pectinase 35 Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 38 2.1- Vật liệu hoá chất 38 2.1.1- Enzyme thương mại 38 2.1.2- Hóa chất 39 2.2- Các phương pháp tiến hành thực nghiệm 39 iv 2.2.1- Các phương pháp đònh lượng 39 2.2.2- Phương pháp cố đònh enzyme 45 2.2.3- Phương pháp tính toán 51 Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 54 3.1- Quá trình cố đònh -amylase 54 3.1.1- Sự cố đònh Termamyl (-amylase thương mại) alginate 54 3.1.2- Sự cố đònh Termamyl CMC – alginate 58 3.1.3- Sự cố đònh Termamyl chitosan-BC 62 3.1.4- Sự cố đònh Termamyl polyacrylamide 65 3.1.5- Sự cố đònh Termamyl celite 67 3.2- Quá trình cố đònh AMG (glucoamylase thương mại) 74 3.2.1- Sự cố đònh AMG vật liệu alginate-chitosan 74 3.2.2- Sự cố đònh AMG polyacrylamide 76 3.2.3- Sự cố đònh AMG Celite 77 3.2.4- Sự cố đònh AMG phương pháp nhốt trình tạo mạng silica gel 81 3.2.5- Sự cố đònh AMG theo phương pháp CLEA 82 3.3- Quá trình cố đònh Cellusoft (cellulase thương mại) 87 3.3.1.- Sự cố đònh Cellusoft alginate 87 3.3.2- Sự cố đònh Cellusoft polyacrylamide 89 3.3.3- Sự cố đònh Cellusoft theo phương pháp CLEA 92 3.4- Quá trình cố đònh Pectinex Ultra SPL (pectinase thương mại) 94 3.4.1- Sự cố đònh Pectinex alginate 94 3.4.2- Sự cố đònh Pectinex vật liệu chitosan 98 3.4.3- Sự cố đònh Pectinex polyacrylamide 104 3.4.4- Sự cố đònh Pectinex celite 108 3.4.5- Sự cố đònh Pectinex silica gel 111 v 3.4.6- Sự cố đònh Pectinex theo phương pháp CLEA 117 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 120 Kết luận 120 Đề nghò 122 DANH MỤC CÔNG TRÌNH 123 TÀI LIỆU THAM KHẢO 124 PHỤ LỤC vi Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt acry : Acrylamide alg : Alginate AMG, GA : Glucoamylase APTES : Aminopropyltriethoxysilane BC : Bacterial cellulose bđ : Ban đầu bis : Bisacrylamide cđ : Cố đònh CLEA : Cross-linked enzyme aggregates CMC : Carboxymethyl cellulose CP E : Chế phẩm enzyme CT : Công thức dd : Dung dòch E : Enzyme glu : Glutaradehyde h : Giờ HL : Hàm lượng Hđ : Hoạt độ HS : Hiệu suất PEI : Polyethylenimine pp : Phương pháp tb : Trung bình td : Tự V : Thể tích VSV : Vi sinh vật UI : Đơn vò hoạt độ (của enzyme)  : Tổng số vii Danh mục bảng Bảng 1.1: Khả chòu nhiệt enzyme tự enzyme dạng CLEA11 Bảng 1.2: Kết hoạt độ hiệu cố đònh lipase lên chất mang28 Bảng 2.1: Tiến hành khảo sát enzyme cố đònh chất mang thực nghiệm 53 Bảng 2.2: Khảo sát thông số giá trò biểu thò thực nghiệm 53 Bảng 3.1: Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố đònh Termamyl alginate 55 Bảng 3.2: nh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ dạng Termamyl cố đònh 56 Bảng 3.3: Ảnh hưởng nồng độ alginate, CMC đến khả cố đònh enzyme 58 Bảng 3.4: nh hưởng nhiệt độ, pH đến hoạt độ dạng Termamyl cố đònh CMC-alginate 59 Bảng 3.5: nh hưởng thời gian bảo quản đến hoạt độ dạng Termamyl cố đònh 60 Bảng 3.6: Khả phân cắt số chất dạng Termamyl cố đònh gel CMC- alginate 61 Bảng 3.7: Kết hiệu suất cố đònh Termamyl BC chitosan 62 Bảng 3.8: nh hưởng nồng độ chitosan đến hiệu suất cố đònh Termamyl BC-chitosan 63 Bảng 3.9: nh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ dạng Termamyl cố đònh BCchitosan 64 Bảng 3.10: nh hưởng tỉ lệ acrylamide, bis acrylamide đến hiệu suất cố đònh Termamyl polyacrylamide 65 viii Bảng 3.11: nh hưởng pH, nhiệt độ đến hoạt độ dạng Termamyl cố đònh polyacrylamide 66 Bảng 3.12: Khảo sát phương pháp hoạt hóa celite 67 Bảng 3.13: Khảo sát tỉ lệ enzyme:celite đến hiệu suất cố đònh Termamyl 68 Bảng 3.14: Ảnh hưởng nồng độ 3-APTES đến hiệu suất cố đònh 68 Bảng 3.15: Yếu tố nhiệt độ pH ảnh hưởng đến hoạt độ dạng Termamyl cố đònh celite .69 Bảng 3.16: Sự biến đổi hoạt độ dạng Termamyl cố đònh theo điều kiện bảo quản .70 Bảng 3.17: Khả tái sử dụng chất mang celite 70 Bảng 3.18: Hiệu suất cố đònh enzyme sau bọc alginate so với enzyme cố đònh celite không bọc alginate 71 Bảng 3.19: So sánh hiệu suất cố đònh dạng chất mang chitosan alginate cố đònh AMG 75 Bảng 3.20: Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố đònh AMG celite77 Bảng 3.21: nh hưởng pH, nhiệt độ đến hoạt độ dạng AMG cố đònh celite 78 Bảng 3.22: nh hưởng nồng độ alginate thời gian cố đònh đến hiệu suất cố đònh AMG celite-alginate .79 Bảng 3.23: nh hưởng nhiệt độ, pH đến hoạt độ AMG cố đònh celitealginate 80 Bảng 3.24: Hiệu suất cố đònh AMG trình tạo mạng silica gel 82 Bảng 3.25: Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố đònh AMG theo phương pháp CLEA 84 Bảng 3.26: nh hưởng nồng độ alginate tỉ lêï enzyme đến hiệu suất cố đònh Cellusoft alginate 88 ix Bảng 3.27: Ảnh hưởng thời gian bảo quản đến hoạt độ dạng Cellusoft cố đònh alginate 89 Bảng 3.28: nh hưởng nồng độ polyacrylamide đến hiệu suất cố đònh Cellusoft 90 Bảng 3.29: nh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ dạng Cellusoft cố đònh polyacrylamide 91 Bảng 3.30: Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất cố đònh Cellusoft theo phương pháp CLEA 92 Bảng 3.31: Ảnh hưởng nồng độ alginate đến cố đònh Pectinex .94 Bảng 3.32: nh hưởng nhiệt độ, pH đến hoạt độ dạng Pectinex cố đònh alginate 95 Bảng 3.33: Ứng dụng pectinase cố đònh xử lý dòch chanh dây .96 Bảng 3.34: Một số yếu tố nh hưởng đến hiệu suất cố đònh Pectinex chitosan 98 Bảng 3.35: Ảnh hưởng nồng độ alginate đến hiệu suất cố đònh Pectinex dạng phức chitosan bọc alginate 100 Bảng 3.36: nh hưởng thời gian bảo quản đến hoạt độ dạng Pectinex cố đònh chitosan bọc alginate 100 Bảng 3.37: So sánh hiệu suất cố đònh Pectinex dạng phức chất mang chitosan-alginate 101 Bảng 3.38: Ảnh hưởng thời gian cố đònh kích thước tạo hat gel đến hiệu suất cố đònh Pectinex chitosan-carrageenan 102 Bảng 3.39: Khảo sát ảnh hưởng điều kiện bảo quản đến hoạt độ dạng Pectinex cố đònh chiosan-carrageenan 103 Bảng 3.40: nh hưởng tỉ lệ bis : acrylamide tỉ lệ enzyme đến hiệu suất cố đònh Pectinex 104 p.45 Bảng V.24: Khảo sát khả phản ứng liên tục dạng Pectinex cố đònh chitosan-alginate (OD0=0,272, a= 2,0016g, n=100) Thời gian (phút) Ban đầu 10 20 30 40 50 60 70 80 OD m 0,550 0,525 0,501 0,464 0,442 0,397 0,364 0,335 0,303 OD 0,278 0,253 0,229 0,192 0,170 0,125 0,092 0,063 0,031 UI Ecđ SUI E cđ/ SUI lần đầu (%) 1,6824 1,5124 1,3492 1,0976 0,9480 0,6420 0,4176 0,2204 0,0028 100 89,895 80,195 65,240 56,348 38,160 24,822 13,100 0,166 d- Bước đầu khảo sát dạng enzyme cố đònh vật liệu kết hợp chitosan alginate Quá trình thí nghiệm thực lần lấy giá trò trung bình Bảng V.25: Ảnh hưởng phương pháp tạo phức đến hiệu suất cố đònh protein ( HL protein bđ=66,898 mg, V=250) Dạng phức ODtb C (mg/ml)  HL cl (mg) HL protein cđ (mg) HS cđ protein (%) chitosan+ (alginatepectinase) (VEbđ=4,17ml, V=750, OD0=0,027, HL protein bd=278,965 mg) (alginate-pectinase) +chitosan (VEbđ=4,17ml, V=750, OD0=0,025) 0,1545 0,1665 124,833 154,138 55,251 0,153 0,1648 123,585 155,385 55,699 Bảng V.26: Ảnh hưởng phương pháp tạo phức đến hiệu suất cố đònh enzyme Dạng phức a (g) Chitosan +(alginate-pectinase) (OD0=0,260,  UI Ebđ=63,843, mEcđ = 24,496g, n=100) 2,40678 (alginate-pectinase) +chitosan (OD0=0,264,  UI Ebđ=63,843 , mEcđ = 24,879g, n=100) 2,4872 OD mẫu ODtb Hđ Ecđ (UI/g)  UI E cđ HS cđ E (%) 0,5583 0,29825 0,756 18,5165 29,003 0,5728 0,30875 0,76025 18,9193 29,635 p.46 V.2.3- Cố đònh Pectinex chitosan-carrageenan Hàm lượng protein Pectinex: 60,55 mg/ml (y= 0,0009x + 0,0047 (R2 = 0,9974) - Hoạt độ E bđ =19,77 (UI/ml) , Hoạt độ riêng= 0,03265(UI/mg protein) - Tỉ lệ E : chất mang=1 : (ml/g) ( 5g chitosan : 10g carrageenan ) Enzyme sau cố đònh lên phức với tỉ lệ : a- Khảo sát ảnh hưởng thời gian cố đònh kích thước tạo hat gel đến cố đònh Pectinex chitosan-carrageenan Bảng V.27: Ảnh hưởng thời gian cố đònh đến hiệu suất cố đònh protein chitosan-carrageenan ( HL protein ban đầu =121,1mg , V=500) Thời gian (giờ) ODtb C (mg/ml) 0,5 0,144 0,131 0,136 0,139 0,146 0,1548 0,1403 0,1459 0,1492 0,1570  HL protein cl (mg) 77,389 70,167 72,944 74,611 78,500  HL protein cđ (mg) 43,711 50,933 48,156 46,489 42,600 HS cđ protein (%) 36,095 42,059 39,765 38,389 35,178 Bảng V.28: Ảnh hưởng thời gian cố đònh đến hiệu suất cố đònh enzyme chitosancarrageenan (UI Ebđ = 39,54, n=20) Thời gian (giờ) 0,5 ODtb 0,313 0,416 0,364 0,319 0,302 a (g) 0,5245 0,5432 0,5096 0,5111 0,5254 Hđ Ecđ (UI/g) m Ecđ (g) S UI E cđ HS cđ E (%) 0,7323 10,0788 7,3805 18,666 0,9649 10,1876 9,8305 24,862 0,8898 10,1259 9,0100 22,787 0,7674 10,0798 7,7357 19,564 0,7026 10,0626 7,0695 17,879 Bảng V.29: Ảnh hưởng kích thước hạt đến hiệu suất cố đònh protein chitosancarrageenan (Hạt chitosan tạo máy bơm nhu động với loại dây: d = 2mm d = 1,2mm, V=500) 0,1392  HL protein cl (mg) 69,611  HL protein cđ (mg) 51,489 42,518 0,1448 72,389 48,711 40,224 Loại hạt ODtb C (mg/ml) Hạt to (d = 2mm) 0,130 Hạt nhỏ (d= 1,2mm) 0,135 HS cđ protein (%) Bảng V.30: Ảnh hưởng kích thước hạt đến hiệu suất cố đònh enzyme chitosan-carrageenan (UI Ebđ = 39,54 ,n=20) Loại hạt a (g) ODtb Hạt to (d = 2mm) Hạt nhỏ (d= 1,2mm) 0,5411 0,5425 0,388 0,414 Hđ Ecđ (UI/g) 0,8983 0,9612 m Ecđ (g) 10,1414 10,1748 SUI E cđ 9,1102 9,7798 HS cđ E (%) 23,04 24,73 p.47 b- Khảo sát điều kiện bảo quản dạng Pectinex cố đònh chitosan-carrageenan Bảng V.31: Khảo sát điều kiện bảo quản dạng Pectinex cố đònh chitosancarrageenan sau tuần (Hđ Ecđ ban đầu = 0,946 UI/g, n=20) Dung dòch Nhiệt độ oC a (g) ODtb Đệm pH=4,1 Đệm pH=4,1 KCl KCl 30 30 0,554 0,548 0,572 0,539 0,401 0,381 0,390 0,357 Hđ Ecđ (UI/g) 0,909 0,870 0,855 0,824 Hoạt độ enzyme cố đònh / Hoạt độ ban đầu (%) 96,089 91,966 90,381 87,104 Enzyme giữ dd đệm pH = 4,1 4oC c- Tái sử dụng dạng Pectinex cố đònh chitosan-carrageenan Bảng V.32: Tái sử dụng dạng Pectinex cố đònh chitosan-carrageenan (a=0,966g, n=20) Lần OD SUI E cđ SUI E cđ/ SUI lần đầu (%) Lần OD SUI E cđ SUI E cđ/ SUI lần đầu (%) 10 0,712 0,689 0,679 0,648 0,631 0,634 0,626 0,616 0,609 0,592 0,926 0,895 0,882 0,839 0,816 0,820 0,810 0,796 0,787 0,763 100 96,625 95,157 90,608 88,113 88,553 87,379 85,912 84,884 82,390 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0,572 0,617 0,560 0,521 0,498 0,416 0,446 0,425 0,419 0,412 0,736 0,797 0,721 0,667 0,636 0,524 0,565 0,536 0,528 0,519 79,454 86,058 77,693 71,970 68,595 56,561 60,963 57,882 57,001 55,974 V.3- Sự cố đònh Pectinex polyacrylamide Y=0,0005x+0,0037 Mẫu enzyme tự khối lượng 1,136g tương đương 1ml, chuyển g sang ml HL protein bđ=73,854 (mg/ml chế phẩm E); Hđ Ebđ = 19,97 (UI/ml chế phẩm ); Hoạt độ riêng = 0,27 (UI/mg protein E) (tỉ lệ enzyme : chất mang = : 1) V.3.1- Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng cố đònh Pectinex polyacrylamide Bảng V.33: Ảnh hưởng tỉ lệ Bis-acrylamide sử dụng đến hiệu suất cố đònh protein (V=500) HL HL HL HS cđ C Tỉ lệ Acr: V E td ODtb Protein Protein protein protein (mg/ml) Bis (ml) bđ (mg) cl (mg) cđ (mg) (%) 13:1 1,6370 0,0763 0,1452 120,90 72,60 48,30 39,950 14:1 1,6200 0,0711 0,1348 119,64 67,40 52,24 43,664 15:1 1,6128 0,0675 0,1276 119,11 63,80 55,31 46,436 16:1 1,5998 0,0702 0,1330 118,15 66,50 51,65 43,716 17:1 1,5925 0,0728 0,1382 117,61 69,10 48,51 41,246 18:1 1,6032 0,0774 0,1474 118,40 73,70 44,70 37,753 p.48 Bảng V.34: Ảnh hưởng lượng Bis-acrylamide sử dụng đến hiệu suất cố đònh Pectinex polyacrylamide ( n=20) Tỉ lệ Acr: Bis 13:1 14:1 15:1 16:1 7:1 8:1 V E bđ (ml) 1,637 1,62 1,6128 1,5998 1,5925 1,5834 mE cđ (g) 8,4975 8,2666 8,2902 8,8008 8,6949 8,6794 a (g) ODtb 0,2873 0,3078 0,3077 0,3210 0,3090 0,3120 0,289 0,329 0,380 0,345 0,324 0,288 Hđ Ecđ (UI/g) 1,223 1,319 1,544 1,332 1,291 1,122  UI Ebđ 32,691 32,351 32,208 31,948 31,802 31,621  UI Ecđ HS cđ E (%) 10,395 10,900 12,803 11,723 11,229 09,739 31,796 33,692 39,751 36,695 35,308 30,798 Bảng V.35: Ảnh hưởng tỉ lệ enzyme/chất mang sử dụng đến hiệu suất cố đònh protein (V=500) Tỉ lệ E: chất mang 0,5:1 2:1 3:1 4:1 E bđ OD tb C (mg/ml) 0,4128 1,5978 2,4082 3,1941 0,019 0,051 0,074 0,067 0,0306 0,0946 0,1406 0,1266 HL Protein bđ (mg) 30,49 118,00 177,86 235,90  HL Protein cl (mg) 15,3 47,3 70,3 63,3 HL protein cđ (mg) 15,19 70,70 107,56 172,60 HS cđ protein (%) 49,820 59,915 60,475 73,167 Bảng V.36: Ảnh hưởng tỉ lệ enzyme sử dụng đến hiệu suất cố đònh Pectinex polyacrylamide ( n=20) Tỉ lệ E : chất mang 0,5:1 1:1 2:1 3:1 4:1 V E bđ 0,4128 0,8375 1,5978 2,4082 3,1941 mEcđ (g) 6,1920 6,7840 7,8283 8,9861 9,3215 a (g) 0,438 0,319 0,325 0,316 0,338 ODtb 0,217 0,305 0,334 0,301 0,313 Hđ Ecđ (UI/g) 0,579 1,170 1,270 1,164 1,136  UI Ebđ 8,244 16,725 31,908 48,092 63,786 UI Ecđ 3,584 7,937 9,939 10,458 10,592 b- Các yếu tố ảnh hưởng đến dạng Pectinex cố đònh polyacrylamide Bảng V.37: Ảnh hưởng nhiệt độ đền hoạt độ Pectinex tự (n=500) Nhiệt độ0C 20 30 40 50 60 70 ODtb Hđ E td (UI/ml) Hoạt độ tương đối (%) 0,532 17,048 75,581 0,618 19,972 88,544 0,648 20,992 93,066 0,694 22,556 100 0,641 20,754 92,011 0,584 18,816 83,419 HS cđ E (%) 43,474 47,454 31,150 21,746 16,606 p.49 Bảng V.38: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ dạng Pectinex cố đònh polyacrylamide ( n=20) Nhiệt độ 0C a(g) ODtb 20 30 40 50 60 70 0,2969 0,2862 0,2771 0,2591 0,2702 0,2795 0,237 0,277 0,275 0,291 0,278 0,242 Hđ E cđ (UI/g) Hoạt độ tương đối (%) 0,946 1,171 1,200 1,367 1,245 1,029 69,203 85,662 87,783 100 91,075 75,274 Bảng V.39: Ảnh hưởng pH dd phản ứng đến hoạt độ Pectitnex tự (n=500) pH 3,6 3,9 4,2 4,5 4,8 5,1 ODtb Hđ E td (UI/ml ) Hoạt độ tương đối (%) 0,4353 13,76 58,475 0,6109 19,73 83,847 0,6350 20,55 87,329 0,7227 23,53 100 0,6129 19,80 84,136 0,5468 17,55 74,585 Bảng V.40: Ảnh hưởng pH dd phản ứng đến hoạt độ dạng Pectinex cố đònh polyacrylamide ( n=20) pH 3,6 3,9 4,2 4,5 4,8 5,1 a(g) 0,2940 0,2595 0,2647 0,2619 0,2651 0,3344 ODtb 0,234 0,252 0,272 0,278 0,263 0,281 Hđ Ecđ (UI/g) 0,941 1,160 1,240 1,285 1,192 1,018 Hoạt độ tương đối (%) 73,230 90,272 96,498 100 92,763 79,222 c- Khảo sát khả ứng dụng tái sử dụng dạng Pectinex cố đònh polyacrylamide Bảng V.41: Ứng dụng dạng pectinex cố đònh polyacrylamide phản ứng liên tục (a= 3,005g, n=100) Thời gian phản ứng (phút) Ban đầu 10 20 30 40 50 UI E cđ ODtb 0,577 0,563 0,563 0,554 0,552 0,546 3,7156 3,6204 3,6204 3,5592 3,5456 3,5048 SUI E cđ/ SUI lần đầu (%) 100 97,438 97,438 95,791 95,425 94,327 Thời gian phản ứng (phút) 110 120 130 140 150 160 UI E cđ ODtb 0,464 0,478 0,458 0,463 0,451 0,443 2,9472 3,0424 2,9064 2,9404 2,8588 2,8044 SUI E cđ/ SUI lần đầu (%) 79,320 81,882 78,222 79,137 76,940 83,895 p.50 60 70 80 90 100 0,502 0,511 0,489 0,491 0,481 3,2056 3,2668 3,1172 3,1308 3,0628 86,274 87,921 83,895 84,261 82,431 170 180 190 0,444 0,434 0,425 75,659 73,829 72,182 2,8112 2,7432 2,6820 Bảng V.42: Khảo sát tái sử dụng dạng Pectinex cố đònh polyacrylamide ( n=100, a=3,013g) Số lần OD tb SUI E cđ SUI E cđ/ SUI lần đầu (%) 0,470 0,458 0,458 0,451 0,449 0,444 0,428 0,416 2,988 2,906 2,906 2,859 2,845 2,811 2,702 2,621 100 97,269 97,269 95,676 95,221 94,083 90,442 87,711 Số lần ODtb SUI E cđ SUI E cđ/ SUI lần đầu (%) 10 11 12 13 14 15 16 0,397 0,399 0,391 0,378 0,389 0,372 0,377 0,367 2,492 2,505 2,451 2,362 2,437 2,322 2,356 2,288 83,387 83,842 82,021 79,063 81,566 77,697 78,835 76,560 V.4- Sự cố đònh Pectinex celite a- Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng cố đònh Pectinex celite Đường chuẩn protein y=0,0009x+0,0047 Bảng V.43: Phương pháp hoạt hóa celite ảnh hưởng đến hiệu suất cố đònh protein ( HL protein ban đầu = 265,2mg, VEbđ=4ml, V=1500) PP hoạt hóa ODo OD C (mg/ml) Glu 2% Cồn + HN03 (Cồn+HNO3) +Glu 0,028 0,028 0,040 0,125 0,119 0,126 0,1337 0,1270 0,1348  HL protein cl (mg) 200,50 190,50 202,17  HL protein cđ (mg) 64,70 74,70 63,03 HS cđ protein (%) 24,397 28,167 23,768 Bảng V.44: Phương pháp hoạt hóa ảnh hưởng đến hiệu suất cố đònh Pectinex celite (HL Ebđ = 0,5 g, UI E bđ = 67 , V Ebđ=4ml, n=100) PP hoạt hoá ODtb a (g) Glu 2% Cồn + HN03 (Cồn+HNO3)+Glu 0,803 0,893 0,78 0,751 0,7372 0,7622 Hđ E cđ (UI/g) 6,994 7,955 6,686 mE cđ (g) UI E cđ HS cđ E (%) 2,0775 2,0767 2,0773 14,530 16,521 13,889 21,686 24,657 20,729 Pectinex ban đầu pha loãng với nồng độ khác nhau, trường hợp thể tích dung dòch enzyme sử dụng 6ml 1g celite Hàm lượng protein ban đầu =66,3 mg/ml (y=0,0009x+0,0047) p.51 Bảng V.45: nh hưởng tỉ lệ enzyme : celite đến hiệu suất cố đònh protein (Thời gian cố đònh 45 phút, V=2500) V E bđ (ml) 0,6 Tỉ lệ pha loãng (lần) 10 ODtb 0,1312 0,0634 0,0409 0,0224 0,0155 C (mg/ml) 0,1406 0,0652 0,0402 0,0197 0,0120 HL protein cl (mg) 351,39 163,06 100,56 49,17 30,00 HL protein bđ (mg) 397,8 198,9 132,6 66,3 39,78 protein cđ (mg) 46,41 35,84 32,04 17,13 9,78 HS cđ protein (%) 11,667 18,021 24,166 25,842 24,585 Bảng V.46: Tỉ lệ enzyme : celite đến hiệu suất cố đònh Pectinex celite (Hđ Ebđ = 16,75 UI/ml, V Ebđ=4ml, n=100) V E bđ ODtb (ml) 0,660 0,482 0,569 0,283 0,6 0,179 a (g) 0,9736 0,972 0,9709 0,9692 0,9431 Hđ Ecđ (UI/g) 4,396 3,158 3,771 1,771 1,070 m Ecđ (g) UI Ecđ 2,1111 2,0857 2,0767 2,0249 2,0142 9,281 6,587 7,831 3,586 2,155 UI E bđ 100,5 50,25 33,5 16,75 10,05 HS cđ E (%) 9,234 13,108 23,376 21,409 21,446 Bảng V.47: Ảnh hưởng nhiệt độ cố đònh đến hiệu suất cố đònh protein (12ml dung dòch enzyme pha loãng lần 2g celite (V= 1000,  HL protein bđ= 281,2 mg) Nhiệt độ cố đònh (0C) 30 35 40 45 50 75 ODtb 0,1936 0,1915 0,1898 0,1870 0,1838 0,1789 C (mg/ml) 0,2099 0,2076 0,2057 0,2026 0,1990 0,1936  HL protein cl (mg) 209,89 207,56 205,67 202,56 199,00 193,56  HL protein cđ (mg) 71,31 73,64 75,53 78,64 82,20 87,64 HS cđ protein (%) 25,360 26,189 26,861 27,967 29,232 31,168 Bảng V.48: Ảnh hưởng nhiệt độ cố đònh đến hiệu suất cố đònh Pectinex celite ( UI E bđ=67 UI/4ml, n=100) Nhiệt độ (0C) 30 35 40 45 50 75 ODtb a (g) Hđ E cđ (UI/g) m Ecđ (g) UI Ecđ HS cđ E (%) 0,496 0,506 0,497 0,493 0,455 0,235 0,4 0,4077 0,4017 0,3949 0,3935 0,4039 7,912 7,929 7,895 7,963 7,334 3,441 2,0684 2,0727 2,0770 2,0736 2,0543 2,0839 16,365 16,434 16,398 16,512 15,066 7,171 24,426 24,530 24,476 24,643 22,487 10,704 p.52 o pH cố đònh Để khảo sát ản h hưởng pH trình cố đònh, ta dùng đệm acetate (CH3COOH 0,2M CH3COONa 0,2M) Dung dòch chế phẩm Pectinex Ultra SP-L pha loãng lần dung dòch đệm pH khác Bảng V.49: Ảnh hưởng pH đến hiệu suất cố đònh protein (HL protein ban đầu = 281,2 mg, nhiệt độ phòng, V=1000) pH cđ ODtb C (mg/ml) 3,0 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 7,0 0,202 0,194 0,196 0,184 0,188 0,185 0,199 0,2192 0,2103 0,2126 0,1992 0,2037 0,2003 0,2159 HL protein cl (mg) 219,222 210,333 212,556 199,222 203,667 200,333 215,889 HL protein cđ (mg) 61,978 70,867 68,644 81,978 77,533 80,867 65,311 HS cđ protein (%) 22,040 25,202 24,411 29,153 27,572 28,758 23,226 Bảng V.50: Ảnh hưởng pH đến hiệu suất cố đònh enzyme ( UI E bđ= 66,987 UI, n=100) pH 4,5 5,5 ODtb 0,525 0,635 0,601 0,669 0,618 0,587 0,526 a (g) Hđ Ecđ (UI/g) m Ecđ (g)  UI Ecđ HS cđ E (%) 0,5014 6,705 2,0373 13,660 20,393 0,5404 7,606 2,0479 15,576 23,251 0,5032 7,708 2,0457 15,768 23,540 0,5261 8,252 2,0277 16,733 24,978 0,5459 7,317 2,0222 14,796 22,089 0,5294 7,147 2,0264 14,483 21,620 0,5024 6,705 2,0421 13,692 20,441 Bảng V.51: Ảnh hưởng thời gian cố đònh đến hiệu suất cố đònh protein (V=1000) Thời gian cđ (phút) ODtb C (mg/ml) 15 30 45 60 120 240 360 0,183 0,193 0,172 0,164 0,176 0,185 0,209 0,1981 0,2092 0,1859 0,1770 0,1903 0,2003 0,2270 HL protein cl (mg) 198,111 209,222 185,889 177,000 190,333 200,333 227,000 HL protein bđ (mg) 250,5333 281,200 250,5333 250,5333 250,5333 250,5333 281,2000 HL protein cđ (mg) 52,422 71,978 64,644 73,533 60,200 50,200 54,200 HS cđ protein (%) 20,924 25,597 25,803 29,351 24,029 20,037 19,275 p.53 Bảng V.52: Ảnh hưởng thời gian cố đònh đến hiệu suất cố đònh Pectinex celite ( UI E bđ = 66,987, n=100) Thời gian cđ (phút) 15 30 45 60 120 240 360 ODtb a (g) 0,437 0,516 0,579 0,470 0,480 0,378 0,389 0,4296 0,4409 0,4519 0,4262 0,4640 0,4070 0,4274 Hđ E cđ (UI/g) 6,433 7,487 8,252 7,011 6,586 5,804 5,702 mEcđ (g) UI E cđ HS cđ E (%) 2,0712 2,0325 2,0277 2,0722 2,0777 2,0597 2,0882 13,324 15,217 16,733 14,528 13,684 11,954 11,907 19,890 22,715 24,980 21,687 20,428 17,847 17,776 b- Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến dạng Pectinex cố đònh celite Bảng V.53: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ enzyme tự enzyme cố đònh celite (V Etự = ml) Nhiệt độ (0C) OD 20 30 40 50 60 70 0,456 0,508 0,613 0,657 0,644 0,553 E td (n=500) Hđ E td Hoạt độ tương (UI/ml) đối (%) 14,464 67,912 16,232 76,214 19,802 92,976 21,298 100 20,856 97,925 17,762 83,398 a (g) OD 0,1014 0,1045 0,1061 0,1053 0,1045 0,1022 0,455 0,665 0,644 0,590 0,574 0,552 E cđ (n=20) Hđ E cđ (UI/g) 5,6923 8,2565 7,8628 7,2251 7,0722 6,9386 Hoạt độ tương đối (%) 68,944 100 95,232 87,508 85,656 68,944 V Enzyme tự = ml Bảng V.54: So sánh ảnh hưởng pH dung dòch phản ứng đến hoạt độ Pectinex tự dạng cố đònh celite pH 3,5 4,5 5,5 ODtb 0,523 0,59 0,606 0,546 0,51 0,488 E td (n=500) Hđ E td Hoạt độ tương (UI/ml) đối (%) 16,742 85,576 19,020 97,219 19,564 100 17,524 89,573 16,300 83,316 15,552 79,493 a (g) ODtb 0,1046 0,1051 0,1017 0,1053 0,1033 0,1024 0,646 0,650 0,738 0,802 0,661 0,642 E cđ (n=20) Hđ E cđ (UI/g) 8,0015 8,0152 9,4600 9,9632 8,2997 8,1203 Hoạt độ tương đối (%) 80,311 80,449 94,950 100 83,304 81,503 p.54 c- Khảo sát khả tái sử dụng Bảng V.55: Khảo sát khả tái sử dụng dạng Pectinex cố đònh celite (a=0,1134g, Cơ chất : pectin 0,5%,Tốc độ bơm : 5,33 ml/phút, n=20) Số lần ODtb 0,710 0,696 0,663 0,624 0,563 0,529 SUI E UI E cđ/  UI cđ lần đầu (%) 0,924 100 0,905 97,939 0,860 93,082 0,807 87,342 0,724 78,364 0,678 73,359 Số lần 10 11 ODtb 0,529 0,503 0,366 0,406 0,387 0,361 SUI E UI E cđ/ UI cđ lần đầu (%) 0,678 73,359 0,642 69,532 0,456 49,368 0,511 55,255 0,485 52,459 0,449 48,632 V.5- Sự cố đònh Pectinex silica gel Phương trình đường chuẩn protein: y = 0,0008x (R2=0, 9947) HL protein bđ =69,875 (mg/ml), Hđ Ebđ= 1,62 (UI/ml) V.5.1- Quá trình cố đònh Pectinex trình tạo mạng silica gel (pp1, sơ đồ 2.17) Lượng chất tham gia ban đầu theo tỉ lệ mol 1: 1, tương ứng mNa2SiO3.9H2O = 8,8752 (g) m(NH4)2SO4 = 4,1325 (g) (*) a- Một số yếu tố ảnh hưởng cố đònh Pectinex trình tạo mạng silica gel (pp 1) Bảng V.56: Khảo sát lượng enzyme sử dụng ban đầu so với lượng chất mang (*) đến hiệu suất cố đònh protein (V=1500) VE (ml)  HL protein bđ (mg) ODtb C (mg/ml) 349,375 493,625 698,750 838,500 0,091 0,122 0,171 0,212 0,11317 0,15246 0,21326 0,26474 10 12  HL Protein cl (mg) 170,625 228,750 320,625 397,500  HL protein cđ (mg) 178,750 264,875 378,125 441,000 HS cđ protein (%) 51,163 53,659 54,114 52,594 Bảng V.57: Ảnh hưởng lượng enzyme ban đầu so với lượng chất mang (*) đến hiệu suất cố đònh Pectinex silica gel (OD0=0,032, n=20) VE (ml)  UI E bđ a (g) ODtb Hđ E cđ (UI/g) 10 12 81,0 113,4 162,0 194,4 0,1043 0,1051 0,1017 0,1032 0,248 0,310 0,281 0,264 2,8349 3,6156 3,3487 3,0760 mE cđ (g) 11,19 13,62 18,74 23,18  UI Ecđ HS cđ E (%) 31,723 49,244 62,755 71,302 39,164 43,426 38,737 36,677 p.55 Chọn ml dd E ban đầu ứng với lượng chất tham gia tạo silica gel (*) Bảng V.58: Ảnh hưởng thể tích PEI sử dụng cho ml E ban đầu đến khả cố đònh protein (V Ebđ= 7ml,  HLprotein bđ= 489,125mg, OD0=0,045,v=1000) V PEI ODtb (%v/w) 0,5 0,175 0,131 1,5 0,129 0,130 C (mg/ml) 0,2188 0,1638 0,1613 0,1625 HL protein cl (mg) 218,75 163,75 161,25 162,50 HL protein cđ (mg) 270,37 325,37 327,87 326,62 HS cđ protein (%) 55,277 66,522 67,033 66,777 Bảng V.59: Ảnh hưởng thể tích PEI sử dụng cho ml E ban đầu đến khả cố đònh Pectinex cố đònh silica gel ( UI E bđ = 113,4 , n=20) VPEI (%v/w) 0,5 1,0 1,5 2,0 ODtb a (g) Hđ E cđ (UI/g) 0,412 0,418 0,322 0,252 0,1031 0,1102 0,1106 0,1062 5,0312 4,7811 3,5834 2,8354 mE cđ  UI E cđ (g) 11,08 55,746 13,32 63,684 17,72 63,498 22,14 62,776 HS cđ E (%) 49,159 56,159 55,994 55,358 Enzyme cố đònh thu dạng paste khó bảo quản, nên đem hút chân không nhiệt độ 400C (nhiệt độ khoảng hoạt động cho phép enzyme) với thời gian 4, 6, Ta thu kết quả: sau enzyme khô hoàn toàn, dễ bảo quản sử dụng enzyme giảm khoảng 10% hoạt độ) b- Khảo sát tái sử dụng dạng Pectinex cố đònh silica gel theo pp Bảng V.60: Khảo sát tái sử dụng dạng Pectinex cố đònh silica gel theo pp (n=100, a=0,86g, ODo=0,082) Số lần ODtb SUI E cđ 0,623 4,028 0,617 3,988 0,603 3,892 0,575 3,702 0,556 3,572 0,569 3,661 0,552 3,546 0,538 3,450 SUI E cđ/ SUI lần đầu(%) 100 98,987 96,624 91,898 88,690 90,880 88,015 85,652 Số lần ODtb SUI E cđ 0,524 3,355 10 0,487 3,104 11 0,479 3,050 12 0,441 2,791 13 0,425 2,682 14 0,393 2,465 15 0,353 2,192 SUI E cđ/ SUI lần đầu(%) 83,289 77,043 75,693 69,971 66,577 61,176 54,424 p.56 V.5.2- Cố đònh Pectinex silica gel có hoạt hoá (pp 2, sơ đồ 2.20) HL protein =67,1875 (mg/ml); UI Ebđ=16,528 (UI/ml) Bảng V.61: Khảo sát yếu tố hoạt hoá chất mang silica gel đến hiệu suất cố đònh protein (V Ebđ=2ml, tỉ lệ E:silica gel=2:1 (ml/g), V=500) Quá trình xử lý H2O2 + APTES + Glu APTES + Glu H2O2 + Glu H2O2 + APTES ODt ODo OD 0,125 0,129 0,134 0,143 0,133 0,129 0,153 0,145 0,139 0,154 0,147 0,162 0,041 0,041 0,041 0,044 0,044 0,044 0,044 0,044 0,044 0,044 0,044 0,044 0,084 0,088 0,093 0,099 0,089 0,085 0,109 0,101 0,095 0,110 0,103 0,118 ODtb C (mg/ml)  HL protein cl (mg) HL protein bđ (mg) HL protein cđ (mg) HS cđ protein (%) 0,0883 0,1104 55,188 134,3750 79,188 58,930 0,0910 0,1138 56,875 134,3750 77,500 57,674 0,1017 0,1271 63,563 134,3750 70,813 52,698 0,1103 0,1379 68,938 134,3750 65,438 48,698 Bảng V.62: Khảo sát yếu tố hoạt hoá ảnh hưởng đến hiệu suất cố đònh Pectinex silica gel theo pp (n=250,  UI Ebđ= 33,056 , a =0,35g) Quy trình xử lý H2O2 + APTES + Glu APTES + Glu H2O2 + Glu H2O2 + APTES ODm ODo OD 0,354 0,333 0,322 0,283 0,279 0,254 0,262 0,225 0,247 0,247 0,272 0,283 0,092 0,092 0,092 0,092 0,092 0,092 0,092 0,092 0,092 0,092 0,092 0,092 0,262 0,255 0,247 0,233 0,214 0,195 0,221 0,198 0,191 0,215 0,201 0,193 ODtb Hđ Ecđ (UI/g) mEcđ (g) UI Ecđ 0,255 10,900 1,42651 15,549 0,214 8,909 1,42856 12,727 0,203 8,374 1,43134 11,986 0,203 8,374 1,42859 11,963 HđR (UI/ mg protein) 0,0196 0,0164 0,0169 0,0183 HS cđ E (%) 47,038 38,500 36,261 36,191 p.57 Bảng V.63: Khảo sát tỉ lệ enzyme ban đầu: silica gel đến hiệu suất cố đònh protein (pH =4,2, 60phút, 30oC, V=500, ODo= 0,045) Tỷ lệ E: silicagel (v/w) 1,5 2,0 2.5 3,0 ODm OD 0,126 0,116 0,121 0,127 0,137 0,131 0,175 0,172 0,164 0,198 0,194 0,215 0,081 0,071 0,076 0,082 0,092 0,086 0,130 0,127 0,119 0,153 0,149 0,170 ODtb C (mg/ml) HL protein bđ (mg) HL protein cl (mg) HL protein cđ (mg) HS cđ protein (%) 0,0760 0,0950 100,7813 47,500 53,281 52,868 0,0867 0,1084 134,3750 54,188 80,188 59,674 0,1253 0,1566 167,9688 78,313 89,656 53,377 0,1573 0,1966 201,5625 98,313 103,250 51,225 Bảng V.64 Khảo sát tỉ lệ enzyme silica gel đến hiệu suất cố đònh Pectinex silica gel ( UI E bđ=33,056 , n=100, ODo= 0,092) Tỷ lệ E: silicagel (v/w) 1,5 2,0 2,5 3,0 ODm OD 0,271 0,285 0,276 0,355 0,374 0,366 0,335 0,344 0,357 0,389 0,337 0,331 0,179 0,193 0,184 0,263 0,282 0,274 0,243 0,252 0,265 0,297 0,245 0,239 ODtb a (g) Hđ Ecđ (UI/g) 7,500 m Ecđ (g)  UI E cđ HS cđ E (%) 1,4316 10,737 32,481 0,185 0,14 0,273 0,1395 11,817 1,4234 16,820 50,882 0,253 0,1397 10,826 1,4277 15,456 46,758 0,260 0,1389 11,231 1,4194 15,941 48,226 b- Yếu tố ảnh hưởng đến dạng Pectinex cố đònh silica gel theo pp Bảng V.65: Ảnh hưởng pH dd phản ứng đến hoạt độ dạng Pectinex cố đònh silica gel (n=250, ODo= 0,09 30oC, tỉ lệ enzyme 2(v/w)) pH 3,5 4,2 4,7 5,0 6,1 ODtb 0,200 0,266 0,317 0,314 0,165 a (g) 0,2451 0,2453 0,2449 0,245 0,2457 Hđ E cđ (UI/g) 11,750 16,315 19,882 19,665 9,300 Hđ tương đối (%) 59,101 82,059 100 98,912 46,776 p.58 Bảng V.66: Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ dạng Pectinex cố đònh silica gel theo pp ( pH =4,2, thời gian 60phút, n=200, ODo=0,09) Nhiệt độ (oC) ODtb a (g) Hđ E cđ (UI/g) HS tương đối (%) 25 0,187 0,1963 10,8365 65,748 30 0,268 0,1959 16,4819 100 35 0,2605 0,1961 15,9449 96,742 40 0,2285 0,1958 13,7467 83,405 c- Tái sử dụng dạng Pectinex cố đònh silica gel theo phương pháp Bảng V.67: Khảo sát tái sử dụng dạng Pectinex cố đònh silica gel (a=0,434g, n=100, ODo=0,091) Số lần ODtb 0,617 0,598 0,589 0,562 0,550 0,560 0,516 0,492 SUI E cđ 3,988 3,858 3,797 3,613 3,532 3,600 3,301 3,137 SUI E cđ/ SUI lần đầu (%) 100 96,760 95,225 90,621 88,575 90,280 82,777 78,684 Số lần 10 11 12 13 14 15 ODtb 0,472 0,455 0,427 0,407 0,418 0,381 0,359 SUI E cđ 3,002 2,886 2,696 2,560 2,634 2,383 2,233 SUI E cđ/ SUI lần đầu (%) 75,273 72,374 67,600 64,189 66,065 59,755 56,004 V.6- Sự cố đònh Pectinex theo phương pháp CLEA ( nhiệt độ 50oC, HL protein bđ=66,67 (mg/ml), Hđ E bđ= 1,73664UI/ml) Bảng V.68: Ảnh hưởng nhiệt độ cố đònh đến khả thu Pectinex dạng CLEA (chọn glu 15% = 12mlglu:8mlE , Hđ Ecđ= 13,89312 UI/8 ml) Nhiệt độ (0C) Phòng 40 50 60 m giấy lọc (g) Không 0,5085 0,7818 0,6319 m sau lọc (g) m Ecđ (g) 2,7387 3,2379 3,035 2,2302 2,4561 2,4031 Từ 600C trở lên không khảo sát enzyme hoạt tính Bảng V.69: Ảnh hưởng nhiệt độ cố đònh đến hiệu suất cố đònh Pectinex dạng CLEA (n=10) Nhiệt độ (0C) 40 50 60 Chọn 500C a (g) OD 0,5322 0,439 0,5319 0,102 0,432 0,102 Hđ Ecđ (UI/g) m Ecđ (g) 0,0912 2,2302 0,6218 2,4561 0,0913 2,4031  UI E cđ 0,2035 1,5271 0,2194 HS cđ E (%) 1,465 10,992 1,579 p.59 Bảng V.70: nh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến khả thu Pectinex dạng CLEA Glu (%) Vglu (ml) V E (ml) m giấy lọc (g) m sau lọc (g) m Ecđ (g) 0 20,0 0,7809 1,2753 0,4944 14 11,2 8,8 0,7851 2,7558 1,9707 15 12,0 8,0 0,7818 3,2379 2,4561 16 12,8 7,2 0,7741 2,9459 2,1718 17 13,6 6,4 0,7972 2,7462 1,949 18 14,4 5,6 0,7863 2,5143 1,728 19 15,2 4,8 0,7793 2,3125 1,5332 Bảng V.71: nh hưởng nồng độ glutaraldehyde đến hiệu suất cố đònh enzyme (n=25) mE cđ a (g) ODtb Hđ Ecđ (UI/g) (g) 0,5084 0,154 0,4127 1,970 0,4420 0,192 0,6208 2,456 0,3642 0,209 0,8328 2,172 0,2610 0,254 1,4552 1,949 0,2991 0,252 1,2584 1,728 0,3947 0,33 1,2896 1,533 Glu (%) 14 15 16 17 18 19 UI Ebđ HS cđ E (%) 15,28243 13,89312 12,50381 11,11450 9,72518 8,33587 5,320 10,975 14,466 25,517 22,360 23,716 UI E cđ 0,813 1,525 1,809 2,836 2,175 1,977 Bảng V.72: Ảnh hưởng thời gian cố đònh thu Pectinex dạng CLEA (glutaraldehyde 17% nhiệt độ 50oC) Thời gian (giờ) m giấy lọc (g) 0,5200 0,5387 0,5265 m sau lọc (g) 2,4937 2,5382 2,538 m Ecđ (g) 1,9737 1,9995 2,0115 Bảng V.73: Ảnh hưởng thời gian cố đònh đến hiệu suất cố đònh Pectinex dạng CLEA (n=250,  UI E bđ =111,145) Thời gian (giờ) a (g) 0,5146 0,5188 0,5160 OD 0,464 0,465 0,475 Hđ Ecđ (UI/g) 14,318 14,235 14,641 UI Ecđ 28,259 28,462 29,451 HS cđ E (%) 25,426 25,608 26,498 Bảng V.74: Khảo sát khả tái sử dụng Pectinex cố đònh dạng CLEA ( a=0,256g, n=100) Số lần OD 0,586 0,496 0,457 0,431 0,400 0,380 0,355 SUI E cđ 3,777 3,165 2,900 2,723 2,512 2,376 2,206 SUI E cđ/ SUI lần đầu (%) 100 83,796 76,774 72,093 66,511 62,910 58,409 Số lần 10 11 12 13 - OD 0,322 0,251 0,232 0,206 0,161 0,142 SUI E cđ 1,982 1,499 1,370 1,193 0,887 0,758 SUI E cđ/ SUI lần đầu (%) 52,468 39,684 36,264 31,582 23,480 20,059 [...]... quả gắn Chính vì những vấn đề và đặc biệt ý nghóa khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu qui trình cố đònh và các đặc tính của một số enzyme phân giải polysaccharide Với mục tiêu là: Khảo sát khả 3 năng cố đònh của 4 enzyme thuộc nhóm thủy phân carbohydrate trên các chất mang khác nhau và khảo sát một số đặc tính của enzyme dạng cố đònh tạo được Để đạt được mục... như các cảm biến sinh học Một trong những nhóm enzyme được nghiên cứu thu nhận, tinh sạch và ứng dụng rộng rãi nhất là nhóm enzyme phân giải polysaccharide Đã có những nghiên cứu cố đònh một vài enzyme trong nhóm này nhưng nhìn chung chưa có một công trình nào nghiên cứu hoàn chỉnh làm sáng tỏ về sự phù hợp giữa chất mang và enzyme khi cố đònh và về sự cố đònh đồng thời enzyme trên nhiều chất mang... động của enzyme gặp khó khăn hơn so với enzyme tự do.[9],[18],[39],[82] 1.1.1.3- Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme cố đònh Hoạt tính enzyme cố đònh phụ thuộc vào bản chất và tính chất hóa học của chất mang: tính chất vật lý (tính hòa tan, tính bền, độ trương, tính ưa nước hay kỵ nước) và bản chất hóa học của chất mang đều có ảnh hưởng đến khả năng liên kết, tính bền, hoạt tính sinh học của enzyme cố đònh... hợp bẫy, nhốt và liên kết, kết hợp hấp phụ và liên kết… và có một số thành công khi sử dụng kỹ thuật CLEA tạo liên kết chéo giữa các enzyme 4 Chương 1- TỔNG QUAN 1.1- Enzyme cố đònh 1.1.1- Sơ lược về enzyme cố đònh Mô hình hai pha của enzyme cố đònh Hình 1.1: Mô tả enzyme cố đònh 1.1.1.1- Đònh nghiã: Enzyme không hòa tan (insoluble enzyme) hay enzyme cố đònh (immobilized enzyme) : là enzyme được gắn... nội dung nghiên cứu cần thực hiện như sau: - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng cố đònh các enzyme: amylase, glucoamylase, cellulase và pectinase - trên nhiều loại chất mang khác nhau: hữu cơ và vô cơ, tự nhiên và tổng hợp, dạng kết hợp để làm chất mang cố đònh enzyme Từ đó đưa ra những kỹ thuật cố đònh cho mỗi enzyme trên mỗi chất mang cố đònh - Xác đònh một số đặc tính của enzyme cố đònh... dụng thực tế Các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy rằng: không một enzyme nào lại phù hợp với tất cả các loại chất mang và cũng không một chất mang nào lại phù hợp với tất cả các enzyme Điều này cho thấy cố đònh enzyme không phải là một công việc đơn giản nếu xét về mặt khoa học và thực tiễn của nó Ở Việt Nam tình hình nghiên cứu cố đònh một số enzyme cũng đang được nghiên cứu ở qui mô phòng thí nghiệm,... thống và chưa áp dụng enzyme cố đònh vào qui mô công nghiệp rộng rãi Công trình nghiên cứu của chúng tôi là một đóng góp nhỏ cho sự phát triển kỹ thuật cố đònh enzyme nói riêng và các vật liệu sinh học nói chung để có thể đáp ứng khả năng mở rộng và tính kinh tế trong việc khai thác các enzyme để ứng dụng trong công nghiệp, mơi trường, dược phẩm và trong sự phát triển của các thiết bò hiện đại như các. .. kiềm và ngược lại Còn khi lực ion lớn điện tích chất mang được trung hòa bởi các ion trái dấu và pH tối ưu của enzyme cố đònh cũng giống như enzyme hòa tan [34],[73],[78] Thực hiện đề tài sẽ giúp chúng tôi tìm hiểu biết rõ hơn những đặc điểm của enzyme cố đònh 7 1.1.2- Các phương pháp cố đònh enzyme Enzyme cố đònh thường là những enzyme hòa tan được gắn vào chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau Các. .. đó, các nhà khoa học đã tìm ra được nhiều phương pháp khác nhau để cố đònh enzyme tự do Cố đònh enzyme là 2 gắn hoặc nhốt enzyme vào một chất mang phù hợp để nhằm mục đích chuyển enzyme từ trạng thái hòa tan sang trạng thái không hòa tan, để sử dụng chúng được nhiều lần Ngày nay, kỹ thuật cố đònh enzyme đã được thực hiện trong các nghiên cứu khoa học và cả trong các ứng dụng thực tế Các kết quả nghiên. .. 2.15: Cố đònh enzyme trên phức hợp celite-alginate 49 Sơ đồ 2.16: Cố đònh enzyme trong quá trình tạo mạng silica gel 50 Sơ đồ 2.17: Cố đònh enzyme trong quá trình taọ mạng silica gel và alginate 50 Sơ đồ 2.18: Các bước hoạt hóa silica gel 50 Sơ đồ 2.19: Cố đònh enzyme trên silica gel đã hoạt hoá 51 Sơ đồ 2.20: Cố đònh enzyme theo phương pháp CLEA 51 1 MỞ ĐẦU Trong tế bào sống của ... đề đặc biệt ý nghóa khoa học thực tiễn trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu qui trình cố đònh đặc tính số enzyme phân giải polysaccharide Với mục tiêu là: Khảo sát khả cố đònh enzyme. .. polysaccharide Đã có nghiên cứu cố đònh vài enzyme nhóm nhìn chung chưa có công trình nghiên cứu hoàn chỉnh làm sáng tỏ phù hợp chất mang enzyme cố đònh cố đònh đồng thời enzyme nhiều chất mang... do.[9],[18],[39],[82] 1.1.1.3- Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme cố đònh Hoạt tính enzyme cố đònh phụ thuộc vào chất tính chất hóa học chất mang: tính chất vật lý (tính hòa tan, tính bền, độ trương, tính ưa nước